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溶酶體探針（LysoTracker & LysoSensor）
——酸性細胞器示蹤劑
背景介紹
溶酶體是一種分解蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的細胞器。溶酶體具單層膜囊狀結構，內含60余種酸性水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶等，分解各種外源和內源的大分子物質。溶酶體水解酶的適pH為3.5~5.5，溶酶體內的酸性環(huán)境是依靠膜上的特殊轉運蛋白(H泵)來維持的。溶酶體標志酶為酸性磷酸酶，目前針對溶酶體的定位也主要圍繞酸性磷酸酶展開。
圖1.溶酶體結構
溶酶體功能
溶酶體存在著形態(tài)上的多樣性和異質性，根據溶酶體處于完成其生理功能的不同階段， 大致分為以下幾種：
圖2.溶酶體分類及功能
溶酶體的主要功能是消化作用，主要通過三種途徑消化底物：1.自體吞噬細胞內原有的物質；2吞噬體吞噬有害物質；3.通過內吞作用提供的營養(yǎng)物質。吞噬作用也是細胞獲取營養(yǎng)的一種方式， 細胞通過內吞作用將一些營養(yǎng)物質包進內吞體，在溶酶體酶的作用下，將吞進的營養(yǎng)物質消化，用于合成代謝。
圖3.溶酶體吞噬作用
溶酶體疾病及檢測手段
溶酶體的酶發(fā)生變異，導致底物在溶酶體中大量堆積，影響細胞功能異常引起的疾病稱為溶酶體病。溶酶體與許多疾病的發(fā)生有著極為密切的關系，例如炎癥、矽肺、尤其是先天性溶酶體缺陷等疾病都與溶酶體機能異常有關。溶酶體異常還與休克、類風濕關節(jié)炎、腫瘤等疾病發(fā)生有關聯。
目前檢測溶酶體異常的手段有很多，包括光鏡鑒定法、電鏡鑒定法、.細胞學檢測法等等，這些方法可以直接檢測到溶酶體外形結構、通透性、pH變化等等。目前人類也開發(fā)了一系列溶酶體檢測試劑盒，包括細胞膜通透性（LAP）完成性吖啶橙染色試劑、LAMP抗體及二抗，還包括溶酶體探針類染料，LysoTracker探針和LysoSensor探針。LysoTracker探針和LysoSensor探針可以選擇性地標記和追蹤活細胞酸性細胞器。
Yeasen生物提供多款不同熒光基團標記的溶酶體探針如：綠色、紅色、黃色熒光基團等等，滿足您多標實驗的不同需求。
產品簡介
LysoTracker探針
LysoTracker探針，由熒光基團連接到一個弱堿性基團組成，其中僅弱堿基團可部分提供質子，以維持pH在中性值。這使LysoTracker探針可自由無阻地穿過細胞膜，特征性的聚集在球形細胞器，對酸性細胞器有高選擇性，用于活細胞溶酶體特異性熒光染色。機制尚不明確，可能涉及細胞器膜上的質子化和滯留，一般后面處理細胞的弱堿性滲透劑不會逆轉染色效果。LysoTracker熒光可能在整個細胞內熒光中占很小部分，因此很難通過流式或熒光計定量溶酶體數量。
LysoSensor探針
LysoSensor探針是細胞內的pH熒光指示劑，可通過質子化作用聚集在酸性細胞器內。這個質子化也減弱染料的熒光淬滅性，從而增加熒光強度。因此，與LysoTracker系列探針相比，LysoSensor系列探針隨著細胞器的酸化程度增強，其熒光強度呈極大的pH依賴型(向酸)增強。
產品選擇指南
注：探針標記細胞后，只能用熒光顯微鏡觀察，而不能用流式或熒光酶標儀檢測，因為在總細胞熒光中溶酶體熒光只占非常小的比例。
產品特點
特異性強：高選擇性地識別和標記靶向酸性細胞器，幾乎不對線粒體染色；
種類齊全：多種熒光顏色可供選擇、可與其他熒光染料或蛋白同時使用進行多色分析；
簡單方便：自由滲透細胞膜，一步法染色、標記活細胞細胞器--溶酶體，染料可快速導入；
靈敏度高：納摩爾濃度水平標記活細胞的效果較高。
染色結果
圖5A.4T1細胞染色結果圖。綠色是FITC標記細胞，紅色是LysoTracker Red DND-99 染色溶酶體。
參考文獻：Di L, Yang A , Simin F , et al. Imidazole-Bearing Polymeric Micelles for Enhanced Cellular Uptake, Rapid Endosomal Escape, and On-demand Cargo Release[J]. AAPS PharmSciTech, 2018. 19(6), 2610–2619.
圖5B. Hela細胞染色結果圖。(a) Lyso-Tracker Red DND-99染色Hela細胞；(b) Lysosensor Green DND-189染色Hela細胞
參考文獻：Zhang L, Chen X,, et al. Palladium nanoparticles induce autophagy and autophagic flux blockade in Hela cells. RSC Advances, 2018,8(8), 4130–4141.
FAQ
問題類別 | 問 | 答 |
實驗 咨詢 | 1.四種溶酶體探針的區(qū)別？ | LysoTracker®--不依賴pH的活細胞溶酶體熒光探針（貨號40738和40739）； LysoSensor™--依賴pH的活細胞溶酶體熒光探針（貨號40767和40768）。 |
2.LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO探針原理？ | LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO)是一種pH依賴型顯示雙激發(fā)和雙發(fā)射波長的熒光探針：
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3.染色時，細胞的狀態(tài)？ | 這四種探針是對活細胞中的酸性區(qū)室進行染色。所以必須要在活細胞狀態(tài)下染色。 | |
4.染色完成后，細胞是否能固定后再檢測熒光信號？ | 固定后會破壞溶酶體的酸性環(huán)境從而會造成熒光減弱甚至消失的情況，染色前后均不建議固定。 | |
5.可以和二抗一起孵育嗎？ | 不可以，孵育二抗必須要透化處理，而透化會破壞溶酶體的酸性環(huán)境，影響染色效果。 | |
6.這個探針可以染自噬溶酶體嗎 | 自噬溶酶體和正常的溶酶體在形態(tài)結構上有較大差異，該探針主要是針對常規(guī)的溶酶體染色，對于自噬溶酶體的染色效果不是很確定，可以參考一些使用過該產品發(fā)表的文獻資料確定。 | |
7.植物細胞和組織適用嗎？ | 理論上可以，一般植物細胞或者組織要制成原生質體。 | |
8.可以染色其他酸性細胞器嗎？ | 可以染色其他酸性細胞器，建議極低濃度下才能優(yōu)先選擇染色酸性溶酶體。 | |
9.染色后可以放置一夜，再熒光檢測嗎？ | 建議染色完立即檢測熒光，時間過長，熒光信號會逐漸減弱。 | |
10.用細胞培養(yǎng)基配成工作液以后穩(wěn)定嗎？可以存放多久？ | 工作液是需要現配現用的，不建議保存。 | |
11.檢測儀器？ | 熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、酶標儀、流式細胞儀。 | |
12.如何做到同時染色溶酶體和細胞核的？ | 建議用Hoechst 33258/ Hoechst 33342染色細胞核，這個染料可以直接染活細胞不需要固定操作。 | |
13.保質期多久？ | -20℃避光保存，半年有效。 | |
實驗 問題 | 14.熒光信號較弱？ | 大致有3個原因： 1.溶酶體探針濃度過低，建議適當增大濃度； 2.染色時間過短，建議延長染色時間； 3.染色完之后，放置過長時間才檢測信號；建議染色完立刻檢測。 |
15．沒有熒光信號？ | 大致有3個原因： 1.先用多聚甲醛、乙醛等固定細胞，破壞了溶酶體的酸性環(huán)境。 2.染色完后，又用多聚甲醛固定細胞，或者透化細胞，破壞了溶酶體的酸性環(huán)境；染色前后均不建議固定細胞； 3.染色完到上機檢測這一段時間過長，并且沒有避光處理。建議避光染色，染色完立即檢測熒光信號。 | |
16.在活細胞狀態(tài)下，用50 µM探針染色50 min，然后發(fā)現除了溶酶體，細胞質中也有熒光信號，這主要是什么原因導致？ | 大致有一下3個原因： |
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產品 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格（¥） |
LysoTracker Green DND-26 溶酶體綠色熒光探針 | 40738ES50 | 50μL | 425.00 |
LysoTracker Red DND-99 溶酶體紅色熒光探針 | 40739ES50 | 50μL | 425.00 |
LysoSensor™ Green DND-189 溶酶體綠色熒光探針 | 40767ES50 | 300T | 1533.00 |
LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO) 溶酶體黃/藍色熒光探針 | 40768ES50 | 50μL | 425.00 |
