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干細胞（Stem cells）是未分化的或部分分化的細胞,具有自我更新和多次分化的能力。在一定條件下，可分化成多種功能細胞。未充分分化的干細胞因具有再生各類組織器官和人體的潛在功能，被稱為“萬用細胞"。常見干細胞培養(yǎng)有造血干細胞(HSC)，胚胎干細胞(ESC)，神經(jīng)干細胞(NSC)，多功能干細胞(iPSC)，間充質干細胞(MSC)等干細胞培養(yǎng)。由于干細胞具有再生組織和修復的潛力，來替換身體里受損或生病的細胞，因此在自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、心血管類疾病、骨骼系統(tǒng)疾病、眼科類疾病以及代謝性類疾病等領域有著廣泛的應用前景。
圖.干細胞基礎研究和臨床應用的重大發(fā)現(xiàn)和進展的時間軸【1】
2006年，山中伸彌等科學家把4個轉錄因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）通過逆轉錄病毒載體轉入小鼠的成纖維細胞，使其變成多功能干細胞（iPSC），意味著體細胞能夠被改造發(fā)展成所有類型細胞，開啟了干細胞研究的新紀元，于2012年因該項成果發(fā)現(xiàn)榮獲諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。以“stem cell"作為關鍵詞，在clinicaltrials.gov網(wǎng)站中檢索到，截至2024年8月31日全球干細胞臨床試驗有7253項，其中早期階段(145)、臨床I期(2,448)、II期(3,291)、III期(671)、IV期(166)。目前，國內已批準成立干細胞臨床研究備案機構近150余家，通過審批備案的干細胞臨床研究已達140余項。干細胞研究已成為重要的方向，接下來小翌將帶你了解干細胞的整個培養(yǎng)流程，避免踩坑。
圖.用于干細胞治療的不同細胞來源示意圖【1】
復 蘇
稀釋前將Ceturegel®基質膠和適量體積的DMEM/F12放入4度冰箱過夜融化。
將凍存管內細胞懸液轉移至含3~4ml的H9全培養(yǎng)液的15ml離心管內，以1000rpm，離心5min。
離心后將上清液吸除，輕彈離心管底，使細胞沉淀松散，加入新鮮的H9全培養(yǎng)液2~3ml，輕輕吹打一次使細胞克隆塊懸浮。
轉移至已經(jīng)鋪好Ceturegel®基質膠的6孔板中培養(yǎng)。
復蘇第二天不換液，第三天起每天更換H9細胞全培養(yǎng)液。
注意：復蘇時不能吹打過度，不能吹打成單細胞，保持細胞克隆塊狀，復蘇后48小時換液，期間最好不要挪動細胞。H9復蘇后可能4~5天才開始有克隆出現(xiàn)，7-10天傳代（具體視克隆密度和大小而定）。
傳 代
一般在復蘇后第7~10天傳代，之后常規(guī)傳代為6-7天一次。
在顯微鏡下觀察，直至克隆脫落（一般需要3~6min）。
將帶有脫落克隆的消化液轉移至15ml離心管中，放置一會，待克隆自然沉降后將上層吸除，加入H9全培養(yǎng)液3ml輕輕混勻，放置一會，待克隆自然沉降后將上層培養(yǎng)液吸除，重復一次（即H9全培養(yǎng)液漂洗2遍，沉降后吸掉上清）。
加入H9全培養(yǎng)液3ml，用1ml移液器吹打2-3次，將克隆塊吹散成大小為原來的約1/10（若想得到大小較均一的克隆塊，此時可將細胞靜置片刻，待細胞自然沉降后取懸浮于液體中間層的克隆塊傳代），傳代比例根據(jù)母瓶克隆密度和大小而定，一般1:3~1:5傳代。
放入37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
第二天不換液，第三天起每天換液，換液前顯微鏡下將分化的克隆挑除。
注意：傳代時不能吹打過度，不能吹打成單細胞，保持細胞克隆塊狀，傳代后48小時換液，期間最好不要挪動細胞。每6~7天傳代一次。
凍 存
按傳代的方法將細胞消化下來，漂洗后細胞沉于離心管底部（上述傳代中步驟5）。
逐滴加入已經(jīng)預冷（4℃）的細胞凍存液，一邊加一邊輕輕晃動離心管。
1ml移液器輕輕混勻細胞（保持克隆塊，不可吹打過度），每支凍存管內加入500ul~lml細胞懸液，標記細胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
將凍存管置于程序降溫盒內，-80℃過夜，轉入液氮。
圖.H9干細胞培養(yǎng)結果示意圖
實驗相關產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
Ceturegel® Matrix hESC-Qualified，LDEV-Free 基質膠 | 40190ES08/10 | 5/10 mL |
NSC-27 supplement, serum free, 50X 無血清 NSC-27 添加劑 | 60703ES | 10 mL |
NSC-27 supplement without Vitamin A, serum free, 50X 無血清 NSC-27 添加劑,去除維生素A | 60704ES | 10 mL |
NSC-27 supplement without Antioxidant, serum free, 50X 無血清 NSC-27 添加劑,無抗氧化劑 | 60705ES | 10 mL |
NSC-27 supplement, serum free, 50X(animal origin-free)無血清 NSC-27 添加劑(非動物源) | 60711ES | 10 mL |
NSC-27 supplement without Vitamin A, serum free, 50X(animal origin-free) 無血清 NSC-27 添加劑,去除維生素A(非動物源） | 60712ES | 10 mL |
N-2 supplement,serum free,100X N-2無血清添加劑，100× | 60706ES | 5 mL |
N-2 supplement,serum free,100X N-2無血清添加劑,100X(非動物源） | 60713ES | 5 mL |
DMEM/F-12 Reduced Serum Medium DMEM/F-12減血清培養(yǎng)基 | 41420ES76 | 500 mL |
參考文獻：
【1】HoangDM , PhamPT , BachTQ , NgoATL , NguyenQT . Stemcellbasedtherapyforhumandiseases . SignalTransductTargetTher . 2022Aug6 ; 7 (1) : 272 .doi : 10.1038 / s41392- 022- 01134- 4 . PMID : 35933430 ; PMCID : PMC9357075.
