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在PCR技術(shù)的發(fā)展歷程中，熱啟動(dòng)技術(shù)的出現(xiàn)無疑是一次革命性突破。常規(guī)PCR技術(shù)在反應(yīng)體系配制階段，由于DNA聚合酶在低溫環(huán)境下已具備活性，極易與引物、模板發(fā)生非特異性結(jié)合，從而產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體。這些“副產(chǎn)物"不僅干擾目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增，還會(huì)嚴(yán)重降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性，導(dǎo)致后續(xù)數(shù)據(jù)分析出現(xiàn)偏差甚至錯(cuò)誤。
熱啟動(dòng)技術(shù)通過的溫度依賴性激活機(jī)制，從根源上解決了這一難題。在反應(yīng)體系配制時(shí)，借助物理或化學(xué)修飾手段，暫時(shí)“凍結(jié)"DNA聚合酶的活性，使其無法在低溫下啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)。直到反應(yīng)溫度升至特定閾值，聚合酶的活性才被精準(zhǔn)釋放，開始特異性地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)模板，進(jìn)行高效、準(zhǔn)確的DNA擴(kuò)增。這種精準(zhǔn)的溫度控制，規(guī)避了低溫環(huán)境下的非特異性條帶和引物二聚體的生成，顯著提升了PCR反應(yīng)的特異性。正因如此，熱啟動(dòng)PCR已成為提升PCR特異性的金標(biāo)準(zhǔn)，但傳統(tǒng)熱啟動(dòng)技術(shù)需針對(duì)特定DNA聚合酶篩選適配體或抗體，存在研發(fā)周期長(zhǎng)、操作繁瑣等局限。
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相比之下，引物封閉熱啟動(dòng)技術(shù)獨(dú)辟蹊徑，不再聚焦于聚合酶活性“凍結(jié)"，而是通過高親和性DNA結(jié)合蛋白精準(zhǔn)捕獲引物，從根本上突破了傳統(tǒng)技術(shù)依賴聚合酶修飾的桎梏。基于引物封閉原理，從源頭上阻斷引物間的錯(cuò)誤結(jié)合，解決傳統(tǒng)PCR中引物二聚體形成以及非特異性產(chǎn)物生成的難題。該技術(shù)既規(guī)避了復(fù)雜冗長(zhǎng)的篩選流程，又極大提升了熱啟動(dòng)技術(shù)的應(yīng)用便捷性與反應(yīng)特異性，為PCR技術(shù)的高效、精準(zhǔn)應(yīng)用開辟了新路徑。
圖1. 引物封閉熱啟動(dòng)技術(shù)在PCR擴(kuò)增技術(shù)中的原理圖示意[2]
性能展示
HotStart-Primer Binding Protein (Cat#14563)
翌圣生物全新研發(fā)的HotStart-Primer Binding Protein (Cat#14563)能夠在低溫下可與引物結(jié)合，將引物與Taq DNA聚合酶有效隔離，使其無法被聚合酶利用，從而高效抑制低溫條件下非特異性引物延伸產(chǎn)物及引物二聚體的形成，能夠顯著提升PCR反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率。
有效抑制引物二聚體形成，提高檢出率
通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)評(píng)估翌圣生物HotStart-Primer Binding Protein與進(jìn)口品牌Supplier A同類產(chǎn)品對(duì)PCR反應(yīng)中引物二聚體的抑制效果。結(jié)果顯示，兩種產(chǎn)品均能有效減少引物二聚體形成，并顯著提高目標(biāo)序列的擴(kuò)增效率，表明熱啟動(dòng)蛋白技術(shù)可顯著改善PCR反應(yīng)特異性。
圖2. 翌圣HotStart-Primer Binding Protein提升PCR反應(yīng)特異性數(shù)據(jù)展示
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參考文獻(xiàn)：
[1] Paul N, Shum J, Le T. Hot start PCR[M]//RT-PCR Protocols: Second Edition. Totowa, NJ: Humana Press, 2010: 301-318.
[2] Kubu C J. HotStart-IT®: A novel hot start PCR method based on primer sequestration[J]. BioTechniques, 2008, 44(2): 275-277.
