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ELISA操作常見問題和解決方法

閱讀:1243      發(fā)布時間:2015-9-23
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ELISA操作常見問題和解決方法


ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實驗,是目前廣泛應用于各種抗原抗體檢測的方法,主要有靈敏度高和特異性強的特點。ELISA操作步驟看似簡單,整個測定過程中卻有諸多影響因素,導致檢測結果可能與實際結果偏差較大。為幫助大家分析實驗中常見問題,我們將常見問題的可能原因和解決方法歸納總結于下表:


問題一:高背景或陰性對照值偏高

可能原因

建議

陰性對照孔被陽性對照或樣品污染

洗滌時,勿將洗液溢出孔外。

洗滌不充分

確保在洗滌時每個孔都充滿了液體,確保將殘余液體從孔中移除。

酶結合物過濃

請檢查酶結合物是否按說明書規(guī)定稀釋

孵育溫度過高

檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定

底物在使用前曝光

應保存在暗處,避光。

讀板前停留時間過長

加終止液后3分鐘內讀數


問題二:陽性對照值偏低或低吸光度

可能原因

建議

蒸發(fā)

各步之間,須使用封版膠密封反應板。

溫度不均勻

校準孵育箱,勿疊放反應板。


問題三:邊緣效應

可能原因

建議

蒸發(fā) 

各步之間,須使用封版膠密封反應板

溫度不均勻 

校準孵育箱,勿疊放反應板


問題四:標準曲線不佳 

可能原因

建議

倍比稀釋標準品時未混勻 

稀釋標準品的每一步均需混勻

過早稀釋

標準品在快要使用時稀釋

加入的體積不正確

使用校準過的移液器,快速、等量的將標準品分配到各個微孔中


問題五:標準曲標準曲線良好,但樣本無檢測信號

可能原因

建議

樣本中無檢測物或檢測物含量極低

設置內參,重新實驗

樣本中其他物質影響/掩蓋檢測

作適當稀釋,降低其他物質的干擾,或作系列稀釋,檢測回收率。

樣本中檢測物濃度過高,Hook效應導致假低值

適當倍數稀釋樣本,檢測物濃度盡量在試劑盒檢測范圍內。


問題六:重復性較差

可能原因

建議

微孔中有氣泡

用針尖挑破氣泡

試劑未混勻

確保充分混勻試劑

樣本中有雜質或沉淀物

使用前離心

微孔包被面被吸頭劃破

加液時小心操作

使用用過的封板膠紙

每次須使用新的封板膠封住反應孔

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