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技術(shù)文章

淺談基因的亞克隆

閱讀:4860          發(fā)布時(shí)間:2013-11-15

    亞克隆:細(xì)胞克隆中,對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞來說,從原有的克隆中,再篩選出具有某種特性的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),就是subclone,分為細(xì)胞克隆和分子克隆。

一、亞克隆實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

1、掌握細(xì)菌基因組提取的方法和原理。

2、掌握限制性核酸內(nèi)切酶處理基因組及其結(jié)果分析。

3、掌握基因片段回收的方法。

 

二、亞克隆實(shí)驗(yàn)原理

    細(xì)菌基因組的提?。和ㄟ^堿法或者酶法裂解細(xì)菌之后,可以將胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)全釋放出來。DNA溶于1mol/L的NaCl中,不溶于0.14mol/L的NaCl,而RNA溶于0.14mol/L的NaCl不溶于1mol/L的NaCl中,通過溶液中鹽濃度的變化可以將DNA和RNA分開。氯仿-異戊醇法除去蛋白,2倍體積乙醇將DNA沉淀出來。

    限制性核酸內(nèi)切酶只作用于特定的位點(diǎn),處理基因組后只會(huì)得到有限的片斷。通過單酶切或者多酶切后電泳檢驗(yàn)就可以得到與物種本身有關(guān)的特定的圖譜。

    電泳后選定目的基因的條帶,紫外燈下將含有目的基因的凝膠切下,使用凝膠回收試劑盒,將凝膠溶化后,通過吸附柱時(shí),核酸片段就吸附在柱上,洗脫液洗脫后加入2倍體積乙醇,核酸沉淀,TE溶解沉淀,核酸片段得到回收。

 

三、試劑與器材

1、試劑 E.coli JM109,牛肉膏,胰蛋白胨,NaCl,微量細(xì)菌基因組抽提試劑盒(上海生工),BamH I、Xho1 核酸內(nèi)切酶(Takara),NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(1kb DNA Ladder),凝膠電泳回收試劑盒

2、器材 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),水平電泳儀,漩渦混合儀,紫外檢測(cè)儀,凝膠成像分析系統(tǒng),微量移液器及吸頭。

 

四、操作方法

1.使用LB培養(yǎng)基活化、培養(yǎng)菌體。

2.離心收集菌體,根據(jù)試劑盒說明提取基因組。

3.限制性酶處理基因組。

4.E.coli JM109的基因組經(jīng)過限制性內(nèi)切酶處理后,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像系統(tǒng)將酶切圖譜采集下來并對(duì)其分析。

5.紫外燈下將需要回收的核酸片段切下來,使用凝膠回收試劑盒回收DNA片段。

6.電泳檢測(cè)回收的核酸片段。

 

五、關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng)

1.菌體培養(yǎng)過程要嚴(yán)格無菌,染菌后提取得到的基因組會(huì)成多條帶,酶切的圖譜也會(huì)比較復(fù)雜。

2.基因組提取過程中所使用的器材要嚴(yán)格滅菌,防止核酸酶降解基因組。

3.基因組提取過程不可以劇烈振蕩,防止DNA斷鏈。

4.在內(nèi)切酶zui適條件下充分處理基因組,得到正確的圖譜。

5.瓊脂糖溶化要充分。

6.切下凝膠時(shí)要注意防護(hù)紫外線,電泳結(jié)束之后盡快將膠條切下來,凝膠條要窄,脫尾部分不回收。

 

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