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人外周血淋巴細胞培養(yǎng)_干細胞搜網(wǎng)_www.stemcell.so

閱讀:1279      發(fā)布時間:2014-5-13
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干細胞搜網(wǎng)實驗室人員教您如何做好人外周血淋巴細胞培養(yǎng)

 

在正常情況下,人外周血中是沒有分裂相的,只有在異常情況下才能發(fā)現(xiàn)。植物血球 凝集素(PHA)是人類淋巴細胞有絲分裂的刺激劑,在PHA作用下,原處于Go期的淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞,進而進行有絲分裂。利用PHA這一特性,淋 巴細胞經(jīng)過含有HPA培養(yǎng)液培養(yǎng),在體外便可獲得豐富的含有絲分裂的生長活躍的細胞群體,終止分裂中期的淋巴細胞,例可得到所需的人體染色體圖形。具有用 血量少、操作簡單等優(yōu)點。

  1、實驗材料
  2.5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽或棉球、鑷子、吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液(PRMI 1640、M199)、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、載玻片等。

  2、培養(yǎng)液配制
  無菌條件下配制培養(yǎng)液,每瓶所含下列試劑:
  RPMI 1640或199 90%
  小牛血清 10%
  PHA(自制) 0.1ml 3%
  肝素 10u/ml 2%
  雙抗 100u/ml(選擇)
  分裝于10ml培養(yǎng)瓶內(nèi),每瓶5ml培養(yǎng)液,封口置冷藏柜備用。

  3、操作過程
(1)采樣接種:用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶蓋,用酒精燈火焰過烤,無菌條件下抽取患者外周血0.5-1ml,每瓶加20滴左右,輕搖均勻,盡量避免培養(yǎng)物與瓶蓋接觸;
(2)培養(yǎng):置36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時,每隔12小時左右輕遙1次,以促進細胞生長增殖;
(3)抑止分裂:收獲前2小時左右加秋水仙素,zui終濃度為0.02ug/ml培養(yǎng)液,搖勻后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),以抑止細胞在分裂中期。
(4)終止培養(yǎng):從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶,搖勻后移至10ml尖底離心管中,盡量收集培養(yǎng)細胞。2000rpm8分鐘。
(5)低滲處理:棄上清液,加入預(yù)溫37℃的0.075MKCL8ml,迅速打勻,置37℃培養(yǎng)箱或水浴鍋中10-20分鐘;
(6)預(yù)固定:取出低滲中尖底離心管,輕輕加入新配制的1-2ml 3∶2甲醇:冰乙酸混合液,取相應(yīng)編號滴管用汽泡輕輕軟打2-3下。800-1000rpm8-10分鐘;(7)固定:棄上清液。加入新鮮配制的3∶2甲 醇冰乙酸混合液10ml,輕打混勻,封口置室溫30分鐘以上。1500-2000rpm10分鐘,反復(fù)2-3次;
(8)制片:使用蒸餾水制備冰水片進行滴片。留離心后沉淀細胞,加新鮮配制的固定液,制成細胞懸液,取1-2滴滴片,用于輕輕吹開??烫柡笄謇砜烫栁畚铮?0℃烤片2小時;
(9)收片:待烤箱自然冷卻后,取出烤片,置干凈環(huán)境中或培養(yǎng)箱中以備進行顯帶處理。

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