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miRNA靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證相關(guān)問題解答

閱讀:2810      發(fā)布時(shí)間:2018-1-5
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miRNA主要通過與靶mRNA的結(jié)合,或促使mRNA降解,或阻礙其翻譯,從而抑制目的基因的表達(dá)。用生物信息學(xué)方法準(zhǔn)確快速地預(yù)測(cè)miRNA的靶基因,可以為研究miRNA功能提供線索。 

下面總結(jié)一些熒光素酶實(shí)驗(yàn)中常見的問題。  

 

1轉(zhuǎn)染成功如何判斷? 
 

共轉(zhuǎn)染的幾個(gè)質(zhì)粒中,3' UTR質(zhì)粒及Renilla質(zhì)??赏ㄟ^zui終的luc讀值判斷是否轉(zhuǎn)染成功,而miRNA質(zhì)?;騧imic的轉(zhuǎn)染情況無法從zui終的luc讀值做出判斷,因而針對(duì)miRNA,轉(zhuǎn)染是否成功可用以下方法進(jìn)行: 
i.如轉(zhuǎn)入的miRNA帶熒光標(biāo)記如GFP,則可直接在轉(zhuǎn)染后、細(xì)胞裂解前,顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光; 
ii.如轉(zhuǎn)入的miRNA不帶任何熒光標(biāo)記,可考慮進(jìn)行miRNA的qRT-PCR檢測(cè),通過檢測(cè)結(jié)果判斷實(shí)驗(yàn)組2、4、6是否相對(duì)其對(duì)照組miRNA有顯著過表達(dá)。 
iii.設(shè)置一個(gè)熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染參照組,同批轉(zhuǎn)染一個(gè)組的細(xì)胞,間接反映出同批次實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染情況。  

 

2如何判斷實(shí)驗(yàn)體系無異常,獲得客觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果? 可以從以下幾個(gè)方面來考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性: 

對(duì)照的2個(gè)實(shí)驗(yàn)組,即實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2 luc表達(dá)情況應(yīng)無顯著差異; 轉(zhuǎn)染正常,質(zhì)粒或mimic確保成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞; luc檢測(cè)值在儀器檢測(cè)線性范圍內(nèi)。  
 

3 陰性結(jié)果如何理解? 

在確保實(shí)驗(yàn)體系無異常的前提下,如果zui終檢測(cè)到的結(jié)果是陰性結(jié)果,則基本可以判斷目的miRNA不能直接調(diào)控靶基因的表達(dá),不死心的話就再做一次,如果仍然是陰性結(jié)果,死心吧。 
有的同學(xué)說我一次做出陽性結(jié)果一次做出陰性結(jié)果咋辦?那就恭喜你再重復(fù)吧,結(jié)果一直波動(dòng)的話可能是實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)或其他原因,  

 

4為何與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)有差異? 

實(shí)驗(yàn)中,我們往往會(huì)遇到無法重復(fù)出文獻(xiàn)中結(jié)果的問題,這是肯定的,不同實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)并不能確保與文獻(xiàn)*一致所致。因此,只要我們相信自己就行。  
 

5實(shí)驗(yàn)體系是否可以優(yōu)化?如何優(yōu)化?

該實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)在細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化可通過調(diào)整共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的比例或調(diào)整轉(zhuǎn)染體系來進(jìn)行,設(shè)置合理的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量梯度,觀察microRNA對(duì)靶基因的抑制是否存在劑量效應(yīng)或是否存在變化趨勢(shì)的一致性,從而使結(jié)論更加可靠。  
 

6使用mimics的一些問題? 

有的同學(xué)喜歡使用mimics來做實(shí)驗(yàn),其實(shí)mimics就是體外合成的成熟體miRNA,同樣可以反轉(zhuǎn)錄,用qRT-PCR來檢測(cè)表達(dá)量,但是大家應(yīng)該很少看到有文章把mimics的過表達(dá)量PCR結(jié)果放出來的吧,那是因?yàn)閙imics的過表達(dá)通常在數(shù)萬到數(shù)十萬倍,miIRNA通常會(huì)靶向結(jié)合許多靶基因,這么強(qiáng)的外源過表達(dá)肯定會(huì)引起嚴(yán)重的脫靶效應(yīng),給審稿人把柄質(zhì)疑你嗎?對(duì)于這種找抽的行為大家肯定是積極規(guī)避的。質(zhì)粒介導(dǎo)的miRNA過表達(dá)由于是模擬了前體在生物體內(nèi)的剪切,其過表達(dá)通常在數(shù)十倍到數(shù)百倍,可能引起的脫靶效應(yīng)遠(yuǎn)沒有mimics嚴(yán)重。 
 
7是否還有其他方法驗(yàn)證miRNA對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控? 

驗(yàn)證miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控,也可直接檢測(cè)miRNA過表達(dá)或下調(diào)表達(dá)后,靶基因在mRNA(qRT-PCR方法)或蛋白水平上的變化(Western Blot方法)。

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