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蛋白純化親和層析技術(shù)的原理及應(yīng)用分類
一．蛋白純化親和層析技術(shù)的原理
蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)適應(yīng)于理化性質(zhì)差異性較小而難分離的蛋白質(zhì)，親和層析利用固相介質(zhì)中的配基與混合生物分子之間親和能力不同而進(jìn)行分離，當(dāng)?shù)鞍状謽颖荆ɑ旌掀渌s蛋白、糖類、核酸及小分子）通過層析柱時，與配基能夠特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)就會被吸附固定在層析柱中，其他的蛋白質(zhì)、核酸等對配體不具有特異性的結(jié)合能力，將通過柱子洗脫下來，這種結(jié)合在一定條件下是可逆的，選用適當(dāng)?shù)南疵撘?，改變緩沖液的離子強(qiáng)度和pH值或者選擇更強(qiáng)的配體結(jié)合溶液將結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來，而無親和力的蛋白質(zhì)zui先流出層析住。
蛋白純化親和層析的固相載體具有穩(wěn)定的理化學(xué)性質(zhì)，是一種含有較多化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)的羥基多糖類介質(zhì)，具有機(jī)械強(qiáng)度高，透性好，不溶于水，非特異性吸附少，多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的特點。常用的載體有瓊脂糖凝膠（如GE公司），其他的載體如葡聚糖凝膠，多孔硅膠，樹脂，纖維素等，固相載體首先與特定的配體共價偶聯(lián)形成具有化學(xué)活性的基團(tuán)，即載體的活化，常見的對瓊脂糖凝膠的活化有這么幾種：溴化氰活化載體，即將含有氨基偶聯(lián)到載體的多糖基上（但溴化氰活化需謹(jǐn)慎，有ju毒氰化物放出），以及環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下活化載體，其他的載體的活化劑還有戊二醛等。配體指被特異性蛋白質(zhì)大分子所識別，并與蛋白質(zhì)發(fā)生親和作用的基團(tuán)，如酶的作用底物，輔酶，激素受體，抗原與抗體的結(jié)合等。
蛋白質(zhì)與層析載體上的配體通過配位鍵（如His-tag與Ni2+）、范德華力、疏水力、靜電力等作用發(fā)生生物學(xué)專一性結(jié)合形成復(fù)合物。蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)通過目標(biāo)蛋白質(zhì)與配體間通過特異性親和力吸附而達(dá)到分離純化的目的，具有生物專一性的特點，純化效率高。
二．蛋白純化親和層析的應(yīng)用分類
2.1抗原抗體的免疫親和層析
利用抗原與抗體之間的特異性親和力而進(jìn)行分離的方法。所需的蛋白質(zhì)作為抗原，經(jīng)過動物免疫后形成抗體，抗體與活化的載體上的配基結(jié)合形成具有親和力的吸附系統(tǒng)，利用目標(biāo)蛋白與載體上的抗體特異性結(jié)合而達(dá)到分離純化蛋白的目的。
2.2金屬螯合配位層析
常用于分離對重金屬有較強(qiáng)親和力的蛋白。金屬螯合通常使用亞胺二乙酸（IDA）螯合劑，它與Ni2+、Co2+、Cu2+、Fe2+作用，形成帶有多個配位基的螯合物，固定在載體上，作為配體吸附對重金屬有特異結(jié)合能力的蛋白。例如利用基因工程構(gòu)建帶標(biāo)簽的蛋白His（組氨酸）標(biāo)簽融合蛋白，該蛋白對Ni2+等金屬離子有高選擇的特異性，因此，Ni2+等金屬離子能夠螯合His標(biāo)簽蛋白并吸附在固相載體上，而其他的蛋白質(zhì)不能結(jié)合或者僅能微弱的結(jié)合，從而能夠分離純化目標(biāo)蛋白。
2.3酶與底物特異性層析
GST（谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽融合蛋白純化中，將谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶與重組蛋白或者多肽鏈融合，GST標(biāo)簽融合蛋白通過谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶與固相載體上的還原型谷胱甘肽之間通過酶與底物之間的特異性結(jié)合，從而達(dá)到和其他蛋白分離的目的。
2.4生物素和親和素
生物素和親和素之間具有很強(qiáng)的特異性的親和力。親和素作為配體固定在載體上，將生物大分子用生物素標(biāo)記，通過親和素特異性吸附標(biāo)記的生物大分子而純化分離目標(biāo)物質(zhì)。例如，生物素酰化的胰島素與以親和素為配體的瓊脂糖結(jié)合，胰島素被固定在瓊脂糖柱子上而得到分離。Enrichingbeads
2.5激素與受體蛋白
激素與受體蛋白具有高的親和力，因此親和層析是分離受體蛋白的重要方法。受體蛋白如乙酰膽堿、腎上腺素、生長激素等，都可以利用激素與受體蛋白的特異性結(jié)合而分離。
2.6凝集素與糖蛋白
帶有糖基化的蛋白可用于含有外源凝集素的親和柱進(jìn)行分離，用凝集素作為配體的親和層析是分離糖蛋白的主要方法。
2.7輔酶
利用輔酶對多種酶的親和力可以對多種酶進(jìn)行分離純化。常用的輔酶有核苷酸及其衍生物，比如腺嘌呤核苷酸輔酶，AMP、ADP、ATP等，以及各種維生素，可以用于分離各種激酶和脫氫酶。
2.8氨基酸表面疏水性 固定化氨基酸作為配體，利用氨基酸間的疏水性質(zhì)或者互補(bǔ)蛋白間的親和力，可以分離純化多種蛋白。
2.9多核苷酸和核酸配體
Poly-A配體能夠結(jié)合各種RNA、RNA聚合酶以及其他的poly-A結(jié)合蛋白。poly-U作為配體用于分離mRNA、以及各種poly-U結(jié)合蛋白。DNA作為配體，能夠特異性結(jié)合各種DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶等多種酶類。
Enriching Beads®中瓊脂糖磁珠專為蛋白親和純化而設(shè)計，相比傳統(tǒng)層析親和柱具有磁性分離快，操作簡單且可以輕松實現(xiàn)高通量和大規(guī)模樣品的平行處理的優(yōu)勢，磁性親和技術(shù)有望是新一代的親和工具。
Enriching Beads®對瓊脂糖磁珠進(jìn)行交聯(lián)并活化，如已活化好的NHS配基（加入配體在1個小時即可完成偶聯(lián)反應(yīng)），然后完成對特異性蛋白的親和吸附作用；還有環(huán)氧基、長臂環(huán)氧基、氨基、醛基、羧基；有接入IDA并螯合Ni2+或者其他金屬離子可完成His-tag蛋白的純化；有偶聯(lián)谷胱甘肽并可純化GST融合蛋白；有共價偶聯(lián)Protein A、Protein G可完成免疫共沉淀或者抗體純化等等。