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固相pH梯度
實驗目的：分離蛋白質(zhì)混合物，將樣品進行電泳后，為了不同目的在它的直角方向再進行一次電泳。常說的雙向電泳是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶的電荷和分子 大小對蛋白質(zhì)混合物進行分離。
實驗原理：向等電聚焦的基本原理是利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子的等電點不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進行蛋白質(zhì)的分離和分析。第二向運用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)分子量大小對蛋白質(zhì)進行分離。
基本過程：等電聚焦、平衡及轉(zhuǎn)移到二向、SDS-Page
試劑或儲液：IPG buffer、礦物油、DTT、碘代乙酰胺、過硫酸銨、TEMED、1M DTT、rehydration buffer、平衡液儲液、30%丙烯酰胺單體儲液、1.5M Tris-HCl、10% SDS、10X Tris-甘氨酸系統(tǒng)的電泳緩沖液、0.5%瓊脂糖、水飽和正丁醇、占位液
實驗操作程序：
等點聚焦部分
1．根據(jù)選用的膠條的長度計算上樣體積（見附1），加1M DTT到終濃度50mM需要的體積，補加IPG buffer到終濃度0.2%或者0.5%的體積，加rehydration buffer到該膠條的上樣體積。
2．把各種溶液按計算的體積加入到eppendorf管中，充分混勻，（或者超聲5-10min）14000rpm,10℃離心5min。
3．取出膠條室溫放置10min，平衡膠條的溫度。
4．沿著聚焦盤中槽的邊緣從左至右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡，否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。
5．當所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤中后，用鑷子輕輕的去除預制IPG膠條上的保護層。
6．分清膠條的正負極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標有+，安瑪西亞膠條為）對應于聚焦盤的正極（安瑪西亞為）。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。
7．在每根膠條上覆蓋1-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)析出尿素。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。
8．對好正、負極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序（見附2）。
9．聚焦結(jié)束的膠條立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條吸干礦物油置于平衡管中，-80℃冰箱保存。
注意事項：
參見“雙向電泳培訓班講義（定稿）”中等電聚焦注意事項部分。
附1：
膠條長度、上樣量、上樣體積、等點聚焦的伏小時數(shù)的設(shè)置及說明
膠條長度 上樣體積 銀染上樣量范圍 pH3-10L (ug) 推薦使用量（ug）
7cm 125ul 5-100 50
11cm 185ul 15-200 100
13cm 250ul 25-250 125
17cm 300ul 30-300 150
18cm 350ul 40-400 200
24cm 450ul 50-500 250
銀染VHrs 考染上樣量范圍 pH3-10L (mg) 推薦使用量（ug） 考染VHrs
12000 0.05-0.5 250 22000
20000 0.15-1.2 500 30000
24000 0.25-1.5 650 34000
30000 0.25-2.5 750 40000
36000 0.75-3 1000 46000
52000 1-4 1250 62000
說明：
1．pH3-10NL, pH4-7, pH6-11的上樣量與pH 3-10相比增加1.5-2倍，聚焦伏小時數(shù)延長約10000VHr
2．按照推薦量上預實驗，根據(jù)預實驗結(jié)果調(diào)整上樣量，樣品中蛋白質(zhì)分布均勻按推薦量使用，如果有高豐度的蛋白質(zhì)適當降低上樣量，如果顯得少則適當加大上樣量。聚焦的伏小時數(shù)可以根據(jù)聚焦的情況進行調(diào)整。