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大腸桿菌轉化實驗之電熱恒溫培養(yǎng)箱的應用

閱讀:3515      發(fā)布時間:2019-5-15
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        粘附在細菌細胞表面的質粒DNA在42攝氏度下經(jīng)過短時間的熱擊處理,為DNA的吸收起到促進作用,之后于非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代,等到質粒上所帶的抗菌素基因表達,就能夠生長在還有抗菌素的培養(yǎng)基中了。以下就是大腸桿菌轉化實驗的具體內容。

        實驗目的

        1.向大腸桿菌受體細胞內導入重組的DNA分子進行復制,增殖以及表達從而獲取目的基因。

        2.對大腸桿菌的感受態(tài)細胞效果進行驗證。

        3.分子生物學其他研究的使用。
 

        實驗所需器材

        超凈工作臺,酒精燈,玻璃涂棒,電熱恒溫培養(yǎng)箱,制冰機,恒溫搖床,培養(yǎng)皿(已鋪好固體LB-Amp),1.5ml微量離心管,雙面微量離心管架,干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯⒘恳埔喝悠?,移液器吸頭,旋渦混合器。

 

        實驗所需材料和試劑

        無菌ddH2O,20%IPTG(M/V),2%X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配),培養(yǎng)基(不加抗菌素),LB培養(yǎng)基(加抗菌素),質粒DNA,重組DNA,1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒(滅菌)。

 

        實驗操作步驟

        1.首先調節(jié)恒溫水浴的溫度,將其調至42℃。

        2.將一管(100μl)感受態(tài)菌由零下70℃的超低溫冰柜中取出,立刻使用手指將其加溫融化,然后插入冰中,對其進行5-10分鐘冰浴。

        3.將10μl連接產(chǎn)物(通常是全部連接產(chǎn)物,DNA含量大于或等于100ng)加入,輕輕震蕩后放置冰上20分鐘。

        4.將其輕輕搖勻后插入42℃水浴中,進行90s的熱休克,然后迅速放回冰中,靜置3-5分鐘。

        5.將900μl不含抗菌素的LB培養(yǎng)基分別加入到上述各管中輕輕混勻,之后再搖床的彈簧架上固定,將其在37攝氏度下震蕩30-50分鐘。

        6.往含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中分別滴加從超凈工作臺中取出的100~300μl上述轉化混合液,使用經(jīng)過酒精燈灼燒并且冷卻后的

玻璃涂布棒進行均勻的涂布。

        7.若載體和宿主菌對于藍白斑篩選合適的話,那么在滴完菌液后再將8μl20%IPTG,40μl2%X-gal滴加于平板上,使用經(jīng)過酒精燈灼燒并且冷卻后的玻璃涂布棒進行均勻的涂布。

        8.標記涂好的培養(yǎng)皿,先放置在37攝氏度電熱恒溫培養(yǎng)箱中30-60分鐘,待表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,再倒過來放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。

        9.使用酒精對被細菌污染的桌面進行消毒,寫實驗報告。

        10.對于平板上長出的菌落克隆進行觀察,如果菌落之間能互相分開,說明實驗結果好,對于白色菌斑需要特別留意。

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