Transwell小室共培養(yǎng)條件下內(nèi)皮細(xì)胞對成骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響

時間：2021/7/23閱讀：4170

在科技快速發(fā)展的今天，我國醫(yī)療體系已得到健全發(fā)展。但是骨質(zhì)疏松治療和骨折修復(fù)仍然是一道醫(yī)學(xué)難題。骨質(zhì)疏松癥先有被稱為無聲的“殺手“，后有"靜悄悄的流行病"，它和中風(fēng)相似，喜歡無聲無息地侵襲著人們。現(xiàn)階段如何促進(jìn)和維持骨的生成成為了治療骨質(zhì)疏松的主要解決問題。

針對上述的問題，來自空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室的李高志課題組和其他課題組合作研究，共同探索了在共培養(yǎng)條件下，微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3對成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、凋亡的影響。文章題目為《Transwell小室共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細(xì)胞對成骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響》。

在最終的實驗證實了在Transwell小室共培養(yǎng)條件下，微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖，并抑制其凋亡。為骨質(zhì)疏松和骨折修復(fù)的醫(yī)學(xué)研究提供了突破口。

在介紹實驗之前，我們先了解微血管內(nèi)皮細(xì)胞的基本功能，微血管內(nèi)皮細(xì)胞是內(nèi)襯于血管內(nèi)壁的一層細(xì)胞，它不僅是血管內(nèi)屏障的重要組成部分，而且在調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定、維持正常生理的免疫功能方面起到重要的作用。

骨骼內(nèi)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞還可以分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能和新骨形成。因此，對血管內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間的調(diào)控具有重要的醫(yī)學(xué)價值。

細(xì)胞共培養(yǎng)指兩種或者多種細(xì)胞在一起條件下共同培養(yǎng)?？筛媚M體內(nèi)環(huán)境，這種方法被廣泛運用于細(xì)胞之間相互調(diào)控的研究。

實驗結(jié)果

1.MC3T3-E1/bEnd.3細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立

取復(fù)蘇后3 ~ 6 代生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整至2×105/mL后將1 mL 細(xì)胞懸液均勻接種于6孔板。利用孔徑0.4 µm 的Transwell小室建立非接觸的細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。

取復(fù)蘇后3 ~ 6 代生長狀態(tài)良好的bEnd.3細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，進(jìn) 行細(xì) 胞計數(shù) ，將細(xì) 胞密度調(diào) 整至2×105/mL后將 1 mL 細(xì) 胞懸液均勻接種于Transwell小室內(nèi)底面。然后將接種有bEnd.3細(xì)胞的Transwell小室插入接種有MC3T3-E1細(xì)胞的6孔板中，建立MC3T3-E1和bEnd.3的1∶1比例的細(xì)胞共培養(yǎng)體系。

單獨培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞，孔中不置入小室。兩者均使用共培養(yǎng)培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基與α-MEM培養(yǎng)基混合，比例為1∶1，含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液)，置于37℃孵箱中，保持5% CO2 濃度，每2 d換液1次。

2.實驗分組

對照組：單獨培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞；共培養(yǎng)組：MC3T3-E1細(xì)胞+ bEnd.3 細(xì)胞，實驗重復(fù)3次。

實驗結(jié)論

1、共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。

在共培養(yǎng) 0 h、24 h、48 h、72 h 的4個時間點，對兩組MC3T3-E1細(xì)胞樣本進(jìn)行CCK-8檢測(圖1)。從生長曲線可以看出，對照組和共培養(yǎng)組 MC3T3-E1 細(xì)胞的細(xì)胞活性均隨著時間延長而增加，但共培養(yǎng)組 MC3T3-E1 細(xì)胞的細(xì)胞活性增加更明顯，并且在共培養(yǎng) 48 h 和 72 h 兩個時間點兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P < 0.05)。

PI 單染流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果表明，與 bEnd.3 共培養(yǎng)之后，MC3T3-E1 細(xì)胞周期中 3 個時期的比例出現(xiàn)顯著變化。

Western blotting 的結(jié)果證實，與 bEnd.3 共培養(yǎng)之后，MC3T3-E1 細(xì)胞的 PCNA 蛋白表達(dá)水平顯著升高 (P < 0.01)，表明 MC3T3-E1細(xì)胞的增殖能力較對照組顯著增強。

2、共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制成骨細(xì)胞的凋亡。

Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明 (圖 4)，與bEnd.3 共培養(yǎng)之后，MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率顯著下降 (P < 0.05)。

與 bEnd.3 共培養(yǎng)之后，MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率顯著下降 (P < 0.05)。采用 Westernblotting 檢測凋亡相關(guān)因子 Bax、Cleaved Caspase-3的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，共培養(yǎng)組 MC3T3-E1 細(xì)胞 Bax、Cleaved Caspase-3 的表達(dá)水平顯著降低 (P<0.05)。

上述結(jié)果顯示，在Transwell 共培養(yǎng)條件下，bEnd.3 能夠抑制 MC3T3-E1 細(xì)胞的凋亡。

本研究利用 Transwell 小室，構(gòu) 建 bEnd.3/MC3T3-E1 共培養(yǎng)體系。研究表明，在 Transwell 小室共培養(yǎng)條件下，微血管內(nèi)皮細(xì)胞 bEnd.3 能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1 的增殖，并抑制其凋亡。這為防治骨質(zhì)疏松、構(gòu)建血管化組織工程骨選擇合適的微血管內(nèi)皮細(xì)胞提供了理論依據(jù)，并進(jìn)一步加深了微血管內(nèi)皮細(xì)胞對成骨細(xì)胞功能調(diào)控的理解。

參考文獻(xiàn)：[1]李高志,張麗君,王藝璇,徐麗群,胡澤兵,石菲,張舒,曹新生.Transwell小室共培養(yǎng)條件下微血管內(nèi)皮細(xì)胞對成骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響[J].

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