壓縮是正畸牙齒移動（OTM）期間正畸壓縮力（CF）誘導的特定微環(huán)境的標志之一，因為它能夠影響成牙骨質(zhì)細胞穩(wěn)態(tài)。在OTM期間，壓縮力會觸發(fā)牙周膜（PDL）的炎癥性破骨細胞生成和重塑過程，以進一步產(chǎn)生免疫抑制性缺氧微環(huán)境，從而損害OTM的過程。由于正畸誘導的炎癥性牙根吸收（OIIRR）是正畸牙齒移動的一種嚴重副作用，因此壓縮力對牙骨質(zhì)生理學的作用越來越受到關(guān)注。成牙骨質(zhì)細胞是調(diào)節(jié)牙骨質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及通過參與先天免疫防御來預防OIIRR的負責細胞群。因此，這些細胞在基礎(chǔ)正畸研究中得到了深入研究，特別是關(guān)于它們對正畸壓縮力或牙周病原體及其成分（如肽聚糖）的反應。

牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis）是一種革蘭陰性厭氧菌，被認為是慢性牙周炎進展的關(guān)鍵病原體之一。牙齦卟啉單胞菌細胞壁的一個組成部分是肽聚糖（PGN）。牙齦卟啉單胞菌PGN是一種普遍存在的細菌成分，盡管它具有強大的促炎特性，但也可能在免疫防御反應中發(fā)揮作用。已知它可以刺激人牙齦角質(zhì)形成細胞中豐富的PD-L1蛋白表達，但這尚未在成牙骨質(zhì)細胞中得到證實。重要的是，牙周致病菌之一的牙齦卟啉單胞菌與正畸力（CF）相互作用的分子和細胞機制在成牙骨質(zhì)細胞中尚不了解。

缺氧誘導的PD-L1表達已在多種原發(fā)性和各種癌細胞類型中發(fā)現(xiàn)。缺氧誘導轉(zhuǎn)錄因子（HIF）是正畸力轉(zhuǎn)錄反應的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，據(jù)報道可調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細胞的凋亡過程。然而，目前尚不清楚HIF-1α是否調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細胞中 PD-L1 的表達。去年，德國尤斯圖斯·李比希吉森大學醫(yī)學院口腔正畸學系、牙周病學系的一項研究觀察結(jié)果強調(diào)了理解PD-L1表達在成牙骨質(zhì)細胞中如何調(diào)節(jié)的機制的重要性。

牙齦卟啉單胞菌 PGN 觸發(fā)成牙骨質(zhì)細胞中 PD-L1 的上調(diào)

首先，實驗采用所有方法驗證了不同濃度的牙齦卟啉單胞菌PGN感染后PD-L1在成牙骨質(zhì)細胞中表達的動力學。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用牙齦卟啉單胞菌PGN刺激成牙骨質(zhì)細胞導致PD-L1蛋白表達以濃度依賴性方式上調(diào)，在100 μg/mL時達到峰值。PD-L1的IF染色結(jié)果顯示，牙齦卟啉單胞菌PGN（100 μg/mL）感染細胞中PD-L1的表達明顯高于未受刺激細胞。RT-qPCR基因表達分析顯示，100 μg/mL牙齦卟啉單胞菌PGN 刺激24 h后，PD-L1 mRNA水平明顯高于孵育開始時間點（0）。

這些數(shù)據(jù)表明，牙齦卟啉單胞菌PGN以劑量和時間依賴性方式顯著上調(diào)了成牙骨質(zhì)細胞中的PD-L1分子表達，從4小時開始，在8小時后達到峰值，然后在12小時后衰減至48小時。

壓縮力觸發(fā) OCCM-30 細胞中 PD-L1 和 HIF-1α 的表達

由于壓縮是正畸誘導微環(huán)境的主要組成部分之一，因此，首先在永生化小鼠成牙骨質(zhì)細胞系OCCM-30上研究CF對免疫檢查點之一的程序性死亡受體配體1（PD-L1）表達的影響。結(jié)果表明，載荷量為 2.4 gf/cm2 的CF在8、12和24小時內(nèi)顯著增加了PD-L1 在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達（圖1 B、C）。同樣，通過PD-L1的免疫熒光染色可見，CF組表達強烈上調(diào)（圖1 D）。

進一步研究了CF是否可以誘導OCCM-30細胞中的HIF-1α表達。結(jié)果表明，CF顯著增加了成牙骨質(zhì)細胞中HIF-1α蛋白和基因的表達。還觀察到HIF-1α在壓縮細胞中含量豐富。

因此，這些結(jié)果表明，壓縮力導致成牙骨質(zhì)細胞中PD-L1輕微上調(diào)，促進了HIF-1α的表達。

圖1   響應壓縮力的OCCM-30細胞中PD-L1和HIF-1α的上調(diào)。

用正畸力（2.4 gf/cm2）壓縮成牙骨質(zhì)細胞培養(yǎng)物，在不同時間段（1，2，4，6，8，12和24小時）。（A）生理細胞培養(yǎng)條件和受壓縮力（CF）刺激的細胞的照片。（B、C）通過免疫印跡法測定PD-L1蛋白表達，并通過IF染色檢測其定位。（D）在特定時間點壓縮力下培養(yǎng)的OCCM-30細胞中PD-L1基因表達的RT-qPCR定量。（E、F）通過蛋白質(zhì)印跡法測定HIF-1α蛋白表達。采用IF法評估HIF-1α定位。（G）在特定時間壓縮力下培養(yǎng)的OCCM-30細胞中HIF-1α基因表達的RT-qPCR定量。

壓縮介導牙齦卟啉單胞菌PGN觸發(fā)的PD-L1在成牙骨質(zhì)細胞上的表達

WB分析顯示，PD-L1在牙齦卟啉單胞菌PGN感染的成牙骨質(zhì)細胞中表達上調(diào)（圖2 A-D）。重要的是，特別是在與CF和牙齦卟啉單胞菌PGN共刺激24小時后，PD-L1蛋白表達增強。與對照組（7.19±0.60%）相比，牙齦卟啉單胞菌 PGN或CF也增加了壞死性凋亡的比例（分別為11.22±0.75%；14.79±1.84%）（圖2 E、F）。牙齦卟啉單胞菌PGN聯(lián)合CF顯著增加成牙骨質(zhì)細胞壞死性凋亡（39.55±4.51%）（圖2 E、F）。這些結(jié)果表明，壓縮力可以調(diào)節(jié)牙齦卟啉單胞菌PGN誘導的PD-L1表達并參與成牙骨質(zhì)細胞的壞死性凋亡。

圖2   壓縮力以及牙齦卟啉單胞菌PGN觸發(fā)PD-L1表達并參與壞死性凋亡調(diào)節(jié)。在存在或不存在壓縮力（2.4 gf/cm2）的情況下，用確定濃度的牙齦卟啉單胞菌PGN（100 μg/ mL）處理成牙骨質(zhì)細胞。（A-D）在存在或不存在CF的情況下，PD-L1在牙齦卟啉單胞菌PGN處理的細胞上表達水平的蛋白質(zhì)印跡分析。（E、F）通過流式細胞術(shù)分析顯示了膜聯(lián)蛋白-V FITC和PI染色的代表性圖。壞死性凋亡率（Annexin-V FITC+/PI+）顯示在右上象限。圖形顯示了在存在或不存在壓縮力的情況下，暴露于牙齦卟啉單胞菌PGN的壞死性凋亡細胞的百分比。

壓縮作用下牙齦卟啉單胞菌PGN誘導的PD-L1和HIF-1α在成牙骨質(zhì)細胞中的相關(guān)性

為了探討牙齦卟啉單胞菌PGN誘導的PD-L1表達是否依賴于HIF-1α，使用了HIF-1α抑制劑IDF11774。WB結(jié)果表明，HIF-1α在壓縮作用下的阻斷顯著消除了牙齦卟啉單胞菌PGN誘導的PD-L1蛋白上調(diào)（圖3 A、B）。IF染色顯示，在牙齦卟啉單胞菌PGN刺激下，抑制 HIF-1α對誘導性PD-L1表達具有顯著抑制作用（圖3 C）。此外，在與IDF11774共刺激24小時后，觀察到細胞壞死性凋亡（圖3 C、D）。在存在壓縮力的情況下，IDF11774增加了壞死性凋亡細胞的百分比。牙齦卟啉單胞菌PGN加CF組壞死性凋亡細胞的百分比也有所增加（圖3 E）。因此，這些證據(jù)表明，HIF-1α是壓縮力下牙齦卟啉單胞菌PGN誘導的PD-L1 mRNA和蛋白質(zhì)表達的主要調(diào)節(jié)因子。

圖3   牙齦卟啉單胞菌PGN誘導的PD-L1表達取決于OCCM-30細胞在壓縮力下的HIF-1α信號。將OCCM-30細胞與不同濃度的HIF-1α抑制劑IDF11774預孵育2 h，然后分別用牙齦卟啉單胞菌PGN結(jié)合壓縮力刺激24 h。

（A、B）響應IDF11774（20 uM）的PD-L1蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡分析。（C）代表性IF染色顯示24小時后PD-L1在存在或不存在IDF11774的情況下在牙齦卟啉單胞菌PGN刺激的OCCM-30細胞中表達。（D、E）計算暴露于HIF抑制劑的壞死性凋亡細胞的百分比以及與牙齦卟啉單胞菌PGN和CF共同刺激的壞死性凋亡細胞的百分比。（F）OCCM-30細胞可以在體外釋放可溶性GAS-6，如果HIF-1α被抑制劑阻斷，這種作用就會受損。此外，牙齦卟啉單胞菌PGN誘導的GAS-6釋放被HIF-1α阻斷劑拮抗。

HIF-1α 通過減少 GAS-6 分泌參與成牙骨質(zhì)細胞的免疫調(diào)節(jié)

據(jù)描述，可溶性GAS-6在PDL細胞的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。因此，實驗旨在分析OCCM-30細胞是否可以釋放GAS-6，并且在存在或不存在HIF-1α抑制劑的情況下，通過與牙齦卟啉單胞菌PGN和/或CF的共同刺激是否可以改變其表達。結(jié)果表明，OCCM-30細胞具有釋放GAS-6（27.67 ±11.15 pg/mL）的特性，并且該釋放對IDF11774（18.04 ± 8.43 pg/mL）的使用無顯著影響（圖3 F）。用牙齦卟啉單胞菌PGN處理不會改變GAS-6的產(chǎn)生。有趣的是，在CF和CF加牙齦卟啉單胞菌PGN刺激條件下，IDF11774導致GAS-6的釋放分別降低至10.72±1.82 pg/mL和19.33±8.84 pg/mL。因此，這些結(jié)果表明，GAS-6是成牙骨質(zhì)細胞的免疫調(diào)節(jié)劑，可以通過HIF-1α被釋放和調(diào)節(jié)。

圖4   該方案描述了HIF-1α在成牙骨質(zhì)細胞中的作用方式：牙齦卟啉單胞菌PGN刺激了成牙骨質(zhì)細胞的PD-L1上調(diào)。壓縮力誘導OCCM-30細胞表達HIF-1α和PD-L1。牙齦卟啉單胞菌PGN和壓縮力的共刺激調(diào)節(jié)PD-L1表達，增加OCCM-30細胞壞死凋亡比。抑制HIF-1α可抑制PD-L1表達以及可溶性GAS-6的產(chǎn)生。因此，HIF-1α在壓縮力作用下調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細胞中PGN-誘導的PD-L1表達中起重要作用。

基于體外小鼠成牙骨質(zhì)細胞模型，該研究表明，牙齦卟啉單胞菌PGN上調(diào)了成牙骨質(zhì)細胞的PD-L1，并且這種效果通過HIF-1α響應壓縮力而維持。激活HIF-1α調(diào)節(jié)成牙骨質(zhì)細胞的壞死性凋亡。阻斷HIF-1α可通過減少GAS-6釋放來消除成牙骨質(zhì)細胞的免疫反應。

該數(shù)據(jù)表明，在正畸誘導的微環(huán)境下，免疫檢查點PD-L1與HIF-1α在成牙骨質(zhì)細胞免疫抑制中相關(guān)。此外，通過使用HIF-1α和PD-L1靶向抑制，在OTM期間對牙周炎個體進行OIIRR的免疫治療可能有助于免疫反應。

參考文獻：Yong J, Gr?ger S, Meyle J, Ruf S. Immunorthodontics: Role of HIF-1α in the Regulation of (Peptidoglycan-Induced) PD-L1 Expression in Cementoblasts under Compressive Force. Int J Mol Sci. 2022 Jun 23;23(13):6977. doi: 10.3390/ijms23136977. PMID: 35805974; PMCID: PMC9266671.