E2F1-induced autocrine IL-6 inflammatory loop mediates cancer-immune crosstalk that predicts T cell phenotype switching and therapeutic responsiveness

Keywords: CD4 +/CD8 + T cells; E2F1-STAT3/IL-6 network; Th2-Th1 shift; cancer metastasis; immunomodulation; mathematical modeling; melanoma secretome; tumor microenvironment.

黑色素瘤是一種發(fā)病率越來越高的皮膚癌，一旦達到轉(zhuǎn)移階段就會發(fā)病。一般來說，它被認為是一種免疫原性腫瘤，表達幾種腫瘤特異性以及腫瘤相關(guān)抗原。已在很大一部分患者中檢測到腫瘤特異性 T 細胞反應(yīng)。此外，腫瘤特異性 T 細胞的過繼轉(zhuǎn)移可以介導轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的持久反應(yīng)。最近，免疫檢查點抑制劑（ICI）改變了晚期黑色素瘤的治療，在近 50% 的患者中實現(xiàn)了腫瘤消退和持久的癌癥控制。這些高緩解率強調(diào)了該腫瘤實體的免疫原性。

黑色素瘤病理學中的一個關(guān)鍵表觀遺傳參與者是 E2F1 轉(zhuǎn)錄因子。除了作為細胞周期、代謝的調(diào)節(jié)因子或通過誘導細胞凋亡來響應(yīng)DNA損傷的腫瘤監(jiān)視因子的生理作用外，大量高表達的E2F1還刺激黑色素瘤和其他幾種腫瘤的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化。這種轉(zhuǎn)錄因子（TF）通過促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、新血管生成、外滲和基因組不穩(wěn)定來協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)移擴散，預測疾病惡化和不良患者預后。

為了探索 E2F1 在侵襲性黑色素瘤細胞存在下的免疫調(diào)節(jié)中的作用，德國羅斯托克大學醫(yī)學中心及埃爾朗根-紐倫堡大學腫瘤免疫學實驗室研究團隊在一項實驗中建立了一個共培養(yǎng)系統(tǒng)，并利用轉(zhuǎn)錄組和細胞因子陣列結(jié)合生物信息學和結(jié)構(gòu)建模，確定了一個以 IL6 為中心樞紐的 E2F1 依賴性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究成果發(fā)表于 Frontiers in Immunology 期刊題為“E2F1-induced autocrine IL-6 inflammatory loop mediates cancer-immune crosstalk that predicts T cell phenotype switching and therapeutic responsiveness"。

首先，為了進行基因表達分析，使用人類黑色素瘤組織培養(yǎng)模型，該模型由具有特征性侵襲/轉(zhuǎn)移潛力的不同細胞系組成，這些細胞系顯示 E2F1 水平與細胞運動呈正相關(guān)（圖1 B）。在侵襲性細胞系中敲低 E2F1 后，揭示了 3687 個顯著差異表達基因（DEGs）（圖1 C）。在 DEGs 上應(yīng)用 GSEA 表明，在黑色素瘤中敲低 E2F1 后，EMT 和炎癥反應(yīng)的基因集受到抑制（圖1 D），這意味著 E2F1 調(diào)控基因的多效性結(jié)合了其促轉(zhuǎn)移和免疫調(diào)節(jié)活性。值得注意的是，在比較來自兩個標志集的富集基因后，IL6 成為候選基因（圖1 E）。

將來自 Transfac 和免疫相關(guān)基因的列表與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相結(jié)合，確定了 165 個顯著下調(diào)的基因，這些基因可能對免疫調(diào)節(jié)有影響（圖1 F）。對已鑒定基因的 STRING 分析表明，存在高度互連的網(wǎng)絡(luò)，包括 E2F1、MYC、CD274（PD-L1）、EZH2 和 IL6（圖1 G）。有趣的是，IL6 在 E2F1 消融后表現(xiàn)出下降（圖1 C），在與細胞因子介導的信號傳導、Th2 細胞因子產(chǎn)生和細胞遷移調(diào)控相關(guān)的基因表達亞簇中占據(jù)中心樞紐位置（圖1 H）。這些數(shù)據(jù)支持，E2F1 與免疫調(diào)節(jié)之間的功能聯(lián)系，并強烈表明 IL-6 是該轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的關(guān)鍵因子。隨后對 IL-6 表達和分泌的分析清楚地驗證了其與內(nèi)源性 E2F1 表達的正相關(guān)（圖1 I）。進一步檢測侵襲性黑色素瘤細胞中 E2F1 和 IL-6 以及間充質(zhì)或上皮細胞標志物的表達，并分析它們的相關(guān)性（圖1 J-L），發(fā)現(xiàn)IL-6 通過增強黑色素瘤細胞的 EMT 和侵襲性來促進 E2F1 誘導的轉(zhuǎn)移。

為了進一步評估 IL6 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使用 ChIP-seq 數(shù)據(jù)篩選 IL6 基因上游 10,000 bp 的片段來搜索 E2F1 結(jié)合簇，并在翻譯起始位點近端的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域中心發(fā)現(xiàn)了一個主要的 E2F1 簇。值得注意的是，該區(qū)域還包含一個 STAT3 簇。據(jù)報道，STAT3 和 E2F1 可以根據(jù)細胞環(huán)境產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄協(xié)同作用，研究結(jié)果也證實了 E2F1 和 STAT3 對 IL6 啟動子的協(xié)同增強作用。

圖1    轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中鑒定 E2F1 誘導的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

由于 E2F1 通過 IL-6 協(xié)調(diào)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)（圖1 G），因此，接下來研究了 IL-6 對癌癥免疫串擾的影響，建立一個間接共培養(yǎng)系統(tǒng)，將高表達 E2F1 與 E2F1敲低（E2F1-KD）黑色素瘤細胞系以單一培養(yǎng)的形式或與來自健康供體的 CD4 + 或 CD8 + T 細胞共培養(yǎng)（圖2 A）。通過活/死染色驗證共培養(yǎng)的黑色素瘤和免疫細胞的活力（圖2 B）。

與單一培養(yǎng)的 CD8+（左圖）或 CD4+（右圖）T 細胞相比，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞在上清液中顯示出高濃度的 IL-6（圖2 C）。重要的是，當腫瘤細胞和免疫細胞一起培養(yǎng)時，IL-6 水平顯著增加，這表明黑色素瘤和 T 細胞之間存在正反饋回路。盡管 E2F1 的缺失主要抵消了這種作用，但 IL-6 在共培養(yǎng)條件下仍然可以檢測到，并且只能通過直接抑制來降低。事實上，在 T 細胞存在的情況下，聯(lián)合IL-6 抑制劑和 E2F1-KD 處理以降低升高的細胞因子水平是必要的（圖2 C），而不影響細胞活力。

由于 E2F1 對腫瘤細胞中 GRNs 的影響以及觀察到的 IL-6 分泌的有趣變化，研究人員想知道黑色素瘤和 T 細胞的基因表達譜在多大程度上發(fā)生了改變，以及 E2F1-KD 是否可以在抗腫瘤免疫反應(yīng)的意義上對 T 細胞的基因組程序產(chǎn)生積極影響。因此，對來自單培養(yǎng)和共培養(yǎng)實驗的腫瘤和免疫細胞進行了高通量陣列分析（圖2 A）。

來自共培養(yǎng)的 CD4 + T 細胞和人皮膚黑色素瘤細胞系 SK-Mel-147 對照與其相應(yīng)的單一培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)錄組的比較顯示，總共有 9453 個和 4521 個 DEGs（圖2 D），表明通過細胞因子介導的串擾，在富含E2F1的黑色素瘤和免疫細胞中強烈地誘導轉(zhuǎn)錄變化。值得注意的是，在共培養(yǎng)條件下，IL6 在黑色素瘤細胞中表達強烈（圖2 D），這也驗證了圖中檢測到的 IL-6 分泌增加，并支持存在活性反饋回路。E2F1 敲低將兩種細胞類型中基因表達的這些變化嚴重分降低到 1462（CD4+）和 1708（SK-Mel-47 E2F1-KD）DEGs（圖2 E），強調(diào)了 E2F1 在腫瘤和免疫細胞之間的串擾中的調(diào)節(jié)作用。

為了進一步研究已鑒定基因的潛在生物學功能，對 DEGs（圖2 D）進行了 GO 富集分析，發(fā)現(xiàn)，與 SK-Mel-147 共培養(yǎng)的 CD4+ 中，1315 個上調(diào)基因主要與 T 細胞活化和 MHC-II 相關(guān)反應(yīng)增加（即抗原加工和呈遞）等過程和通路相關(guān)（圖2 F），表明 T 細胞功能。相比之下，1662 個下調(diào)基因與單核細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的趨化性有關(guān)（圖2 F），表明與先天免疫細胞的定向通訊受損。重要的是，該分析還揭示了與 IFN-γ 和 TNF-α 反應(yīng)相關(guān)的基因抑制，這是已知可促進抗腫瘤反應(yīng)的 CD4+ Th1 分化的兩個關(guān)鍵介質(zhì)。這與與 Th1 發(fā)育相關(guān)的 ERK1/ERK2 通路相關(guān)基因的抑制一致（圖2 F）。在黑色素瘤細胞中，發(fā)現(xiàn) 331 個上調(diào)基因的抗原加工/呈遞和免疫反應(yīng)的正調(diào)節(jié)得分很高（圖2 G），這與黑色素瘤的高度活躍免疫表型一致，而下調(diào)的基因主要參與神經(jīng)元過程（圖2 G）。令人驚訝的是，在上調(diào)的免疫激活基因中，發(fā)現(xiàn)了幾種免疫抑制因子，如 CCL2，一種有效的 Th2 細胞趨化劑，以及檢查點抑制劑 CD274（圖2 G），如圖1 G 所示，它通過 IL6 簇連接到已識別的免疫調(diào)節(jié) E2F1 網(wǎng)絡(luò)。

圖2    E2F1 依賴性串擾對黑色素瘤和 CD4 + T 細胞轉(zhuǎn)錄的影響。

考慮到 E2F1 通過 IL-6 的大幅上調(diào)和轉(zhuǎn)錄水平的變化對周圍環(huán)境的影響，使用 TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫分析了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性皮膚癌中 E2F1 的表達與免疫細胞腫瘤浸潤之間的潛在相關(guān)性。基于功能注釋和通路富集（圖2 F ），首先研究了單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的豐度。有趣的是，發(fā)現(xiàn) E2F1 與原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性患者樣本中的單核細胞呈有限的負相關(guān)（圖3 A、B）。然而，在兩個癌癥組中都沒有明顯的中性粒細胞或嗜酸性粒細胞的存在，證實了實驗之前的發(fā)現(xiàn)，即這些免疫細胞類型的趨化性相關(guān)基因下調(diào)（圖2 E）。

更重要的是，這些數(shù)據(jù)顯然支持 E2F1 及其靶點 IL-6 對 Th1/Th2 發(fā)育的強烈影響，如 Th2 細胞因子的產(chǎn)生、ERK1/2 通路的下調(diào)、IFN-γ反應(yīng)或 CCL2 在黑色素瘤細胞中的表達。令人驚訝的是，E2F1 與原發(fā)腫瘤中的 Th2 浸潤呈顯著的正相關(guān)，而 IL6 沒有影響（圖3 C）。相比之下，轉(zhuǎn)移性樣本僅與 Th2 細胞表現(xiàn)出中等相關(guān)性，但也與 Th1 相關(guān)，這可能支持免疫刺激和免疫抑制機制的共現(xiàn)。然而，IL6 可以進一步促進 Th2，如晚期黑色素瘤中 Th2 豐度的增加和隨之而來的 Th1 細胞減少所表明的那樣（圖3 C）。這種轉(zhuǎn)變通過 E2F1 的輔因子 STAT3 的表達進一步放大，該輔因子 STAT3 持續(xù)抑制 Th1。此外，CD274 在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中同時阻斷 Th1 并促進 Th2 浸潤（圖3 D）。

為了驗證 E2F1 依賴性 Th2 轉(zhuǎn)移，使用從黑色素瘤免疫細胞共培養(yǎng)中獲得的上清液進行細胞因子陣列，特別關(guān)注 1 型和 2 型細胞因子（圖3 E、F），發(fā)現(xiàn)CD4+-SK-Mel-147 共培養(yǎng)的上清液顯示所有檢測到的 2 型細胞因子顯著增加，其中 IL-6 表現(xiàn)出強烈的反應(yīng)。引人注目的是，E2F1 的缺失導致大多數(shù)促炎蛋白的顯著減少，但不影響 1 型細胞因子（圖3 F）。與之前的數(shù)據(jù)一致，在高表達 E2F1 黑色素瘤共培養(yǎng)物中測得的 IL-6 水平急劇升高（圖3 E）在 E2F1-KD 下顯著降低（圖3 F）。這些結(jié)果提供了強有力的證據(jù)，表明 E2F1/IL-6 表達增加通過 2 型細胞因子觸發(fā) Th2 驅(qū)動的炎癥，而 Th1 細胞活性受到抑制，建立了免疫抑制環(huán)境。

圖3     E2F1 對與 T 細胞共培養(yǎng)中免疫細胞浸潤和細胞因子釋放的影響。

由上述結(jié)果可知，STAT3 與 E2F1 共同參與 IL-6 表達，對黑色素瘤患者的 Th2/Th1 平衡起著關(guān)鍵作用。為了驗證分子機制和癌癥免疫串擾的動力學，研究人員最終推導出了一個基于核心腫瘤-免疫相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)學常微分方程（ODE）模型，該模型描述了 E2F1-STAT3/IL-6/IL6R 信號通路的激活以及 E2F1 和 STAT3 之間相互作用對 IL-6 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響（自體和旁分泌激活；圖4 A ）。通過修改E2F1表達值的迭代模擬發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ) STAT3 激活下，黑色素瘤細胞中 E2F1 水平的增加可以觸發(fā) IL-6 的表達和分泌（圖4 B）。模擬表明，黑色素瘤細胞高水平的 IL-6 分泌可以通過高水平的 E2F1、高水平的 STAT3 或中等水平的兩種 TFs 來實現(xiàn)（圖4 C）。

此外，還模擬了黑色素瘤分泌的 IL-6 對 TME 中存在的 CD4 + T 細胞的影響（圖4 A），表明高表達 E2F1 黑色素瘤細胞分泌的 IL-6 足以觸發(fā) CD4+ 免疫細胞中 IL-6/IL6R/STAT3 軸的激活，這也可能觸發(fā)其他炎癥因子的分泌。重要的是，該模型在 IL-6 介導的自分泌激活誘導的 CD4+ 反應(yīng)中顯示出超敏感性，因此能夠?qū)颊邤?shù)據(jù)進行以治療為導向的解釋。

圖4     黑色素瘤-CD4 + T 細胞與 E2F1-STAT3/IL-6/IL6R 軸串擾的數(shù)學模型和概述。

總之，該研究確定了一個以 IL6 為中心樞紐的 E2F1 依賴性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。E2F1 誘導的 IL-6 分泌釋放出自分泌炎癥反饋回路，驅(qū)動侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。IL-6 激活的 STAT3 與 E2F1 物理相互作用，并通過結(jié)合 E2F1-STAT3 響應(yīng)性啟動子元件協(xié)同增強 IL-6 表達。引人注目的是，E2F1 缺失減少了典型 2 型細胞因子的分泌，從而啟動了 Th2 到 Th1 表型向抗腫瘤免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)變。這項研究解決了腫瘤相關(guān)微環(huán)境在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的重要分子影響，并將為改進未來的癌癥治療做出重大貢獻。

參考文獻：Spitschak A, Dhar P, Singh KP, Casalegno Gardu?o R, Gupta SK, Vera J, Musella L, Murr N, Stoll A, Pützer BM. E2F1-induced autocrine IL-6 inflammatory loop mediates cancer-immune crosstalk that predicts T cell phenotype switching and therapeutic responsiveness. Front Immunol. 2024 Oct 31;15:1470368. doi: 10.3389/fimmu.2024.1470368. PMID: 39544930; PMCID: PMC11560763.

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