Synergetic role of TRPV4 inhibitor and mechanical loading on reducing inflammation

Keywords: anti-inflammatory phenotype; inhibition, mechanical loading; macrophage polarization; mitogen-activated protein kinase (MAPK); pro-inflammatory (M1) macrophages; three-dimensional (3D) collagen matrix; transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4).

巨噬細胞是一種高度動態(tài)的細胞，參與宿主防御、組織維穩(wěn)和炎癥消退。解決炎癥和促進組織再生的療法通常以巨噬細胞為靶點，通過各種刺激阻斷促炎（M1）激活通路，并調(diào)節(jié)其向抗炎（M2）表型分化。

巨噬細胞具有高度的機械敏感性，它們可以感知并響應微環(huán)境中的機械刺激。機械刺激，包括拉伸、壓縮和間質(zhì)流動，會影響巨噬細胞極化，從而驅(qū)動促炎和抗炎表型之間的轉(zhuǎn)換。巨噬細胞中的機械轉(zhuǎn)導涉及機械傳感器（如粘附分子、細胞骨架成分和離子通道，包括瞬時受體電位香草醛4（TRPV4）通道）的復雜相互作用。

TRPV4 是一種機械敏感離子通道，可由機械刺激、溫度、化學試劑以及內(nèi)源性或外源性配體激活。TRPV4 激活會誘導構(gòu)象變化，從而導致 Ca2+ 內(nèi)流，這在調(diào)節(jié)巨噬細胞行為和炎癥中至關(guān)重要。TRPV4 的藥理學抑制已被證明可以減輕促炎反應。然而，尚未研究 TRPV4 抑制和機械負荷對 3D 環(huán)境中巨噬細胞極化的并發(fā)影響。

為此，美國托萊多大學生物工程系、生物科學系團隊在最近的一項研究中旨在探索不同機械應變和 TRPV4 抑制劑對 3D 膠原蛋白基質(zhì)中包埋的促炎巨噬細胞的協(xié)同作用。通過在基因和蛋白質(zhì)水平上評估巨噬細胞表型變化和相關(guān)的機械轉(zhuǎn)導途徑，揭示了 TRPV4 抑制和機械負荷如何調(diào)節(jié)巨噬細胞的行為，為炎癥消退和組織再生提供潛在的治療見解。研究成果發(fā)表于 Frontiers in Immunology 期刊題為“Synergetic role of TRPV4 inhibitor and mechanical loading on reducing inflammation"。

首先，為了研究 TRPV4 抑制和/或機械應變（0、3% 和 6%，0.1 Hz）下 TRPV4 表達的變化，用抗-TRPV4 抗體標記 TRPV4 離子通道。抗-TRPV4 抗體染色圖像及其定量表明，在不存在抑制劑的情況下，TRPV4 表達隨著機械應變幅度增加（0%-6%）逐漸增加。然而，在 TRPV4 抑制劑存在的情況下，3% 和 6% 機械應變處理后TRPV4 表達降低，且在 6% 機械負荷組中降低更多。

進一步觀察膠原蛋白內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變化、密度和內(nèi)部的降解。Masson 三色染色顯示機械應變和TRPV4抑制劑處理后膠原密度的變化（圖1 A），B-CHP 染色可視化和量化膠原蛋白的降解（圖1 B、C）。

圖1 A 顯示，與對照組（TRPV4（0）-0%）相比，暴露于不含 TRPV4 抑制劑的 3% 機械應變的 M1 巨噬細胞（TRPV4（0）-3% ）組表現(xiàn)出松散的膠原纖維結(jié)構(gòu)。在 TRPV4（0）-3% 組中觀察到的低膠原蛋白含量被 TRPV4 抑制劑部分補償?？傮w而言，與 TRPV4（0）組相比，TRPV4 抑制劑（TRPV4（-）組）處理的 M1 巨噬細胞的膠原纖維更厚。這表明阻斷 M1 巨噬細胞中的 TRPV4 通道可能通過阻止膠原蛋白降解和調(diào)節(jié)巨噬細胞表型來提高膠原蛋白密度。

圖1 B、C顯示，高水平的降解發(fā)生在沒有 TRPV4 抑制劑的 3% 機械應變組（TRPV4（0）-3%）中，與 Masson 三色染色的觀察結(jié)果一致。雖然有或沒有 TRPV4 抑制劑的 0% 機械應變組之間的降解膠原蛋白略有不同，但在 3% 和 6% 機械應變基質(zhì)中添加 TRPV4 抑制劑導致膠原蛋白變性和降解程度降低（圖1 B）。

圖1    （A）用 Masson 三色染色的膠原纖維（藍色）和細胞核（紫色）的組織學圖像。（B）用 B-CH 染色的 3D 基質(zhì)中降解的膠原纖維的熒光圖像。（C）圖像分析中降解膠原蛋白的定量。

膠原纖維密度和降解數(shù)據(jù)的變化表明，在 TRPV4 抑制和機械應變應用后，巨噬細胞存在表型變化。接下來，實驗旨在驗證應用于負載巨噬細胞的 3D 組織基質(zhì)的 TRPV4 抑制劑和/或機械負荷是否在細胞內(nèi)水平上產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)效應。使用 ELISA 評估絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的關(guān)鍵成分 ERK1/2 和 p38 MAPKs。正如巨噬細胞機械轉(zhuǎn)導通路（圖2 A）所示，響應 TRPV4 抑制和機械應變，蛋白激酶C（PKC）被激活，進一步下游傳導到 MAPK、ERK1/2 和 p38 MAPKs，并觸發(fā)炎癥反應和促炎細胞因子和趨化因子的表達。

圖2 B 顯示，機械應變和 TRPV4 抑制劑在不同條件下影響 p38 MAPK 表達。在沒有機械應變（0%）的情況下，p38 MAPK 表達在 TRPV4（0）和 TRPV4 抑制組（TRPV4（-））之間沒有顯著變化。在 3% 的機械應變下，p38 MAPK 表達顯著降低至 133.53 pg/ml。在 6% 的機械應變下，TRPV4（0）組 p38 MAPK 表達顯著下調(diào)至 138.53 pg/ml，（TRPV4（-））組顯著下調(diào)至 149.42 pg/ml。

圖2 C 顯示了每組中與 ERK1/ERK2 蛋白表達相關(guān)的吸光度。在沒有機械應變（0%）的情況下，ERK1/2 表達在 TRPV4（0）和 TRPV4 抑制組（TRPV4（-））之間沒有顯著變化。同樣，在 3% 的機械應變下，即使 TRPV4 抑制，ERK1/2 的表達也沒有顯著變化。然而，在 6% 機械應變下，與無機械應變（0%）組相比，TRPV4（0）組的 ERK1/2 表達顯著下調(diào)至 0.22AU，TRPV4（-） 組的顯著下調(diào)至 0.21AU。

這些數(shù)據(jù)表明，TRPV4 抑制和機械應變聯(lián)合調(diào)節(jié)巨噬細胞 MAPK 信號通路。

圖2    TRPV4 抑制和機械加載后激活的機械轉(zhuǎn)導途徑。（B）p38 MAPK 濃度的變化。（C）ERK1/ERK2 合成。

最后，在確認關(guān)鍵通路受 TRPV4 抑制和機械負荷調(diào)節(jié)后，使用基因表達分析研究了 P38 和 ERK1/2 通路調(diào)節(jié)導致的巨噬細胞表型變化。評估重要促炎標志物（IL-1b、TNF-a、COX2 ）、抗炎標志物（CD163、CCL18）和基質(zhì)降解標志物（MMP13）的表達（圖3）。

關(guān)于炎癥標志物（圖3 A ），數(shù)據(jù)表明，TRPV4 抑制和機械負荷對IL-1β 表達的影響取決于應變幅度。在無機械負荷下，TRPV4（-）和 TRPV4（0）組之間的 IL-1β 水平?jīng)]有顯著變化。當機械應變?yōu)?3% 時，TRPV4（0）組的 IL-1β 表達比無應變組增加了近 5 倍，然而，TRPV4（-）組 IL-1β  表達顯著降低。這表明 TRPV4 抑制可以抵消 3% 機械應變時 IL-1β 表達的上調(diào)。當機械應變?yōu)?6% 時，無論 TRPV4 抑制如何，所有組的 IL-1β 表達均顯著降低。與 TRPV4（0）組的無機械負荷相比，3% 機械應變下 TNF-α 表達顯著增加約 5 倍，然而，TRPV4（-）組在 3% 機械應變下 TNF-α 表達顯著減弱。在 6% 機械應變下，雖然 TRPV4（0）組的 TNF-α 表達與 TRPV4（0）-0% 組相比沒有顯著變化，但在 TRPV4 抑制下，TNF-α表達與 TRPV4（0）-0% 和 TRPV4（0）-6% 組相比均顯著降低。與 TRPV4（0）-0% 組相比，TRPV4（0）組 3% 和 6% 機械負荷的 COX2 表達分別增加了 2.39 倍和 4.88 倍。TRPV4（-）組 3% 和 6% 的機械負荷的 COX2 表達顯著降低。MMP13 基因表達數(shù)據(jù)還表明，與 TRPV4（0）-0 組相比，TRPV4（0）組在 3% 應變時MMP13 表達顯著增加。然而，在 TRPV4（-）組 3% 機械應變下，MMP13 表達顯著降低。在 6% 機械應變時，與有和沒有 TRPV4 抑制的 0% 和 3% 機械應變組相比，MMP13 表達在有和沒有 TRPV4 抑制的情況下進一步降低。

關(guān)于抗炎標志物，在 TRPV4 抑制后，0% 機械應變組的 CD163 表達沒有顯著變化。在 3% 機械應變時，與 TRPV4（0）-0% 組相比，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CD163 表達顯著降低。在 6% 機械應變時，與 0% 和 3% 機械應變組相比，TRPV4（0）組的 CD163 表達顯著增加。在 TRPV4 抑制且 6% 機械應變后，CD163 表達與TRPV4（0）組相比降低。在 TRPV4 抑制后，0% 機械應變組的 CCL18 表達也沒有顯著變化。在 3% 機械應變時，與 TRPV4（0）-0% 組相比，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CCL18 表達降低。在 6% 機械應變時，與 0% 和 3% 機械應變組相比，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CCL18 表達增加。然而，在 3% 和 6% 機械負荷組內(nèi)，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CCL18 表達差異無統(tǒng)計學意義。

熱圖（圖3 B）直觀地顯示了 TRPV4 抑制劑和/或各種機械應變應用后促炎和抗炎基因表達的總體變化。熱圖表明，TRPV4 抑制在 3% 和 6% 的機械應變下顯著降低了促炎基因的表達。具體來說，TRPV4 抑制與 6% 的機械應變協(xié)同促進抗炎巨噬細胞表型變化。

圖3   （A）TRPV4 抑制劑和機械應變對 3D 膠原蛋白基質(zhì)內(nèi)巨噬細胞促炎和抗炎標志物以及基質(zhì)降解標志物表達的影響。（B）TRPV4 抑制劑和/或各種機械加載應用后促炎和抗炎基因表達的熱圖。

雖然基因表達數(shù)據(jù)可能表明在 mRNA 水平上表型向 M1 或 M2 表型轉(zhuǎn)變，但在沒有蛋白質(zhì)水平確認的情況下，仍不確定基因水平的變化是否轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)水平并確認巨噬細胞極化。因此，免疫組化用于可視化靶向促炎巨噬細胞標志物 CD80 和抗炎巨噬細胞標志物 CD206 的表面抗體的結(jié)合。除了促炎和抗炎表面抗體外，細胞核和絲狀肌動蛋白（F-actin）也分別使用 DAPI 和鬼筆環(huán)肽進行標記。將巨噬細胞暴露于有或沒有 TRPV4 抑制劑的各種機械應變幅度下，圖4 顯示了 3D 膠原蛋白基質(zhì)中巨噬細胞的細胞核、促炎和抗炎標志物以及巨噬細胞 F-肌動蛋白的共聚焦圖像。

抗炎標志物 CD206 在 0% 機械應變和 3% 機械應變組中在 TRPV4 抑制后上調(diào)。與沒有 TRPV4 抑制的各自對照相比，TRPV4（-）-0% 和 TRPV4（-）-3% 組中 CD206 表達增加可以明顯證明這一點。相比之下，促炎標志物 CD80 在這些情況下下調(diào)，表明向抗炎表型轉(zhuǎn)變。此外，當 3D 膠原蛋白基質(zhì)中的巨噬細胞承受 6% 的機械應變時，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CD206 表達顯著增加，突出了 6% 機械應變的抗炎作用。

圖4     用 DAPI、F-肌動蛋白和鬼筆環(huán)肽、促炎（CD80）和抗炎標志物（CD206）染色的細胞核的共聚焦顯微鏡圖像。

這項研究為 TRPV4 抑制和機械負荷對 3D 膠原蛋白基質(zhì)中巨噬細胞極化和 ECM 重塑之間的復雜相互作用提供了新的見解。結(jié)果表明，機械負荷，尤其是與 TRPV4 抑制結(jié)合時，可顯著調(diào)節(jié)巨噬細胞表型并影響膠原蛋白完整性，從而突出了 TRPV4 在機械轉(zhuǎn)導和炎癥中的關(guān)鍵作用。這些結(jié)果對于在炎癥和基質(zhì)降解是關(guān)鍵問題的機械動態(tài)組織和疾病中開發(fā)靶向抗炎療法具有重要意義。

參考文獻：Babaniamansour P, Jacho D, Rabino A, Garcia-Mata R, Yildirim-Ayan E. Synergetic role of TRPV4 inhibitor and mechanical loading on reducing inflammation. Front Immunol. 2025 Jan 7;15:1456042. doi: 10.3389/fimmu.2024.1456042. PMID: 39850885; PMCID: PMC11756524.

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