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上海信裕生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第12年

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細(xì)胞凋亡檢測(cè)操作步驟之ELISA法

時(shí)間:2017-5-2閱讀:1221
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細(xì)胞凋亡檢測(cè)操作步驟之ELISA法

細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí),內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶將分解核小體區(qū)間的雙鏈DNA,但核小體本身由于由組蛋白緊密結(jié)合而免受切割,單克隆抗體可以與核小體形成夾心結(jié)構(gòu),可通過(guò)檢測(cè)核小體判斷細(xì)胞是否經(jīng)歷凋亡事件。

(一) 原理

細(xì)胞凋亡的發(fā)生,是由于鈣-鎂依賴性核酸酶進(jìn)入核小體間切割DNA,產(chǎn)生180bp~200bp或其倍數(shù)的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法,應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體,與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu),可特異性檢測(cè)細(xì)胞溶解物中的核小體片段。

(二)材料與試劑

1.采用Boehringer Mannheim公司試劑盒,生物標(biāo)記的小鼠抗組蛋白單克隆抗

體。

2.過(guò)氧化物酶(-POD)標(biāo)記的小鼠抗DNA單克隆抗體

3.鏈霉親合素包被的微孔板

4.DNA-組蛋白復(fù)合物,作為陰性對(duì)照。

5.ABTS底物

6.溶解緩沖液

7.溫育緩沖液

8.底物緩沖液

(三)樣品

1.培養(yǎng)細(xì)胞或離體細(xì)胞的裂解物細(xì)胞裂解步驟:收集細(xì)胞,離心后,用200µl溶細(xì)胞緩沖液重新懸浮,室溫下作用30min。

2.培養(yǎng)細(xì)胞的上清液

3.血漿(血清)

(四)操作方法

1.取樣品離心后(1 000r/min,10min),吸取20µl上清液,加入鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板孔中。

2.另加入80µl免疫反應(yīng)試劑含抗-DNA-POD、抗組蛋白-生物素及溫育緩沖液(按1︰1︰18混合),室溫下孵育2h(置搖床上,250r/min)。

3.取上清,用300µl溫育緩沖液洗滌3次,小心移去洗滌液。

4.加入100µl底物緩沖液,室溫下孵育使顏色變化至適合(置搖床上)。

5.盡快作比色分析(10min~20min內(nèi)),用底物緩沖液作空白對(duì)照,以波長(zhǎng)405nm,參考波長(zhǎng)492nm進(jìn)行檢測(cè)。

(五)結(jié)果判定

按下列公式計(jì)算細(xì)胞釋放的單/低聚核小體片段的特別聚集值:

注:mU=吸收值(10-3)=雙孔吸收值的平均OD值-底物OD值,若樣品的吸收值超過(guò)比色測(cè)定范圍,應(yīng)適當(dāng)稀釋后再檢測(cè)。

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