導(dǎo)讀

生物藥發(fā)生聚集后藥效會(huì)明顯減弱，還可能導(dǎo)致人體出現(xiàn)休克，島津基于流動(dòng)成像技術(shù)開(kāi)發(fā)的粒子分析系統(tǒng)，對(duì)生物藥中亞可見(jiàn)類聚集體以及不溶性微粒物或外源性組分檢測(cè)提供了全新分析手段。

受疫情影響，世界各國(guó)經(jīng)濟(jì)遭受重創(chuàng)，在面臨資本寒冬的大環(huán)境中生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)*，逆勢(shì)增長(zhǎng)，儼然成為世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及健康保障的指明燈。生物藥可對(duì)病原體進(jìn)行特異性攻擊，副作用小，藥效顯著，但易受到環(huán)境溫度、壓力、存儲(chǔ)條件、外界異物引入等因素影響而發(fā)生聚集。研究表明，生物藥發(fā)生聚集后藥效會(huì)明顯減弱或消失，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)因免疫反應(yīng)而導(dǎo)致人體出現(xiàn)休克癥狀。

對(duì)于生物聚集體的分析，小于100nm的不可見(jiàn)聚集體通常使用空間排阻色譜法（SEC）檢測(cè)，對(duì)于10um以上可見(jiàn)區(qū)聚集體美國(guó)藥典和日本藥典規(guī)定使用光阻法進(jìn)行檢定，但在100nm至10um之間并無(wú)合適的定量評(píng)價(jià)方法。2020版中國(guó)藥典第四部關(guān)于不溶性微粒物檢查，第一法光阻法，第二法顯微計(jì)數(shù)法。光阻法只能給出計(jì)數(shù)濃度，不能查看粒子形貌及聚集狀態(tài)，顯微計(jì)數(shù)法雖然能查看粒子形貌及個(gè)數(shù)，但檢定效率低且代表性差。

圖1 生物聚集體大小及粒徑范圍分布

島津iSpect DIA-10基于流動(dòng)成像技術(shù)開(kāi)發(fā)的粒子分析系統(tǒng)綜合了粒度、顯微觀察、粒子計(jì)數(shù)三類儀器的特點(diǎn)，可以精確捕捉粒子形貌、粒徑大小分布、能對(duì)不同大小粒子進(jìn)行有效區(qū)分并給出對(duì)應(yīng)粒徑范圍粒子的計(jì)數(shù)濃度結(jié)果，低僅需50uL樣品消耗且有非常高的靈敏度。對(duì)于生物藥中亞可見(jiàn)類聚集體的檢定以及相關(guān)的不溶性微粒物或外源性組分檢查可提供一個(gè)全新分析手段。

圖2 島津iSpect DIA-10動(dòng)態(tài)顆粒圖像分析系統(tǒng)

應(yīng)用實(shí)例  生物藥中不溶性亞可見(jiàn)微粒物的檢查

樣品處理：人體免疫球蛋白（1mg/mL）兩份，一份80℃加熱3min，一份機(jī)械攪拌10min

樣品分析：使用iSpect DIA-10分別觀察其蛋白聚集形成狀態(tài)

圖3 80℃加熱3min后粒子狀態(tài)               圖4 機(jī)械攪拌10min后粒子狀態(tài)

圖5 粒子檢定結(jié)果

生物蛋白聚集體的粒徑范圍一般在0.2～10um之間，傳統(tǒng)的蛋白聚集體評(píng)價(jià)方法中存在“無(wú)法一次性完成亞可見(jiàn)區(qū)的測(cè)定、”無(wú)法邊施壓（加熱或機(jī)械刺激）邊測(cè)定“、”無(wú)法回收已測(cè)樣品“和“無(wú)法進(jìn)行定量”等問(wèn)題。島津開(kāi)發(fā)的生物醫(yī)藥聚集體評(píng)價(jià)系統(tǒng)Aggregates Sizer可以完美解決上述問(wèn)題。

圖6 生物聚集體評(píng)價(jià)系統(tǒng)Aggregates Sizer

? 定量評(píng)價(jià)生物聚合體濃度（ug/mL）

? 高靈敏度生物聚合體分析，一次僅需0.4mL

? 具有溫度控制及機(jī)械攪拌功能

? 間隔1秒的超快速聚集過(guò)程監(jiān)控

? 可進(jìn)行超過(guò)15小時(shí)的連續(xù)不間斷測(cè)定

應(yīng)用實(shí)例  不同溫度及機(jī)械壓力刺激下，生物蛋白聚集情況分析

樣品：靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）

熱壓力處理：在70℃下對(duì)1mL IVIC溶液進(jìn)行5、7、9分鐘培養(yǎng)后，取0.4ml進(jìn)行測(cè)定

機(jī)械刺激處理：5mL IVIC溶液室溫中按190次/分鐘速度攪拌，進(jìn)行8個(gè)小時(shí)的連續(xù)測(cè)定

通過(guò)Aggregates Sizer生物醫(yī)藥聚集體評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)聚集體粒徑、生成的聚集體濃度隨時(shí)間的變化進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖7、圖8所示。由圖可知，施加熱壓力時(shí)，只在0.2um附近增加聚合體，而1um以上的粒徑處并未生成聚集體。施加機(jī)械刺激時(shí)，隨著時(shí)間的增加，可以發(fā)現(xiàn)在0.2～10um區(qū)域聚集體增加。FDA認(rèn)證中將亞可見(jiàn)區(qū)分為0.2～2um和2～10um兩個(gè)區(qū)域進(jìn)行分別評(píng)價(jià)，而使用Aggregates Sizer只需一次測(cè)定即可得到整個(gè)區(qū)域的聚合體生成量信息。Aggregates Sizer采用的qLD法可以有效評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)在研發(fā)制造過(guò)程中受熱壓或機(jī)械刺激對(duì)生物藥品的影響評(píng)價(jià)。

圖7  70℃加熱                          圖8  190次/分鐘速度攪拌

總結(jié)

生物藥具有副作用小藥效顯著的特點(diǎn)，但在生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用過(guò)程中容易產(chǎn)生聚集而影響藥效，在生物聚集體大量存在的100nm～10um粒徑范圍內(nèi)并無(wú)有效的評(píng)價(jià)方法，無(wú)相關(guān)的在線模擬實(shí)驗(yàn)（溫度、機(jī)械壓力影響）手段、無(wú)法進(jìn)行定量分析、無(wú)法回收已測(cè)樣品等，針對(duì)這一系列問(wèn)題，島津開(kāi)發(fā)的Aggregates Sizer生物醫(yī)藥聚集體評(píng)價(jià)系統(tǒng)以及基于流動(dòng)成像技術(shù)開(kāi)發(fā)的iSpect DIA-10粒子分析系統(tǒng)可以很好的解決上述問(wèn)題，可為生物藥開(kāi)發(fā)及品質(zhì)監(jiān)控提供全新的解決方案。