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通用RT-PCR試劑盒(兩步法M-MLV)

試劑盒組成：

5×M-MLV Buffer、10×PCR Buffer、MgCl₂(25mM)、RNase-free ddH₂O在2-8℃保存一個月對實驗無影響，Oligo(dT)₁₆(10uM)、Random(N)₆(10uM)、dNTPs(10mM)在2-8℃保存一周對實驗無影響，為了你的實驗方便和試劑的穩(wěn)定性，請自行決定試劑存放溫度。試劑解凍后請混勻離心后再使用。微量試劑打蓋前請離心。

產(chǎn)品簡介：

本試劑盒適用于各種 RNA制品的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及隨后的PCR擴(kuò)增。它采用M-MLV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，能夠獲得較長的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。同時，在20ul反轉(zhuǎn)錄體系和50ul PCR反應(yīng)體系中，還可以一次性得到足夠量的PCR產(chǎn)物用于后續(xù)的克隆實驗。本試劑盒使用方便、快捷，可廣泛用于cDNA克隆及目的基因檢測等分子生物學(xué)實驗。

本產(chǎn)品配有兩種引物，一種為Oligo(dT)，另一種為隨機(jī)引物（Random），如果用Oligo(dT)無法得到想要的結(jié)果，可以用隨機(jī)引物（Random）試一下。

 操作步驟：

一、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

1、在冰浴的無RNase的離心管（或者PCR管）中加入如下反應(yīng)成分：
1-5ug總RNA或50-500ng mRNA
2ul Oligo(dT)₁₆或2ul Random(N)₆或者2 pmole基因特異性引物
補(bǔ)RNase-free ddH₂O至13.5ul

2、70℃保溫5min后迅速在冰上冷卻2min，簡短離心收集反應(yīng)液后加入以下各組分：
4ul   5×M-MLV Buffer
1ul   dNTPs
0.5ul  Rnasin
1ul   M-MLV

3、42℃溫浴60min，如果是用隨機(jī)引物，請先將離心管置25℃溫浴10min，再42℃溫浴60min。

4、95℃加熱5min終止反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實驗或-20℃保存。

5、用RNase-free ddH₂O將反應(yīng)體系稀釋到50ul，取2-5ul進(jìn)行PCR反應(yīng)。

二、PCR反應(yīng)

1、按以下各組分配制50ul PCR反應(yīng)體系：
10×PCR Buffer             5ul
MgCl₂                     4ul
dNTPs                    1ul
上游引物（用戶自備）
下游引物（用戶自備）
RT反應(yīng)產(chǎn)物               2ul
Taq Polymerase            0.5ul
ddH₂O                    x ul
Total Volume              50ul

2、簡短離心，上PCR儀擴(kuò)增，瓊脂糖觀察結(jié)果。

注意事項：

1、用于cDNA合成反應(yīng)的相關(guān)試劑和耗材盡可能用DEPC進(jìn)行處理，并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能高壓滅菌時，首先用經(jīng)過滅菌的器具、水等配制溶液后，再將溶液進(jìn)行過濾除菌處理。

2、試劑盒的各組分應(yīng)避免反復(fù)凍融，有效期12個月。

3、RNA樣品要避免反復(fù)多次凍融，應(yīng)使RNA在冰浴中處于融化狀態(tài)。