雙縮脲法蛋白試劑盒這步操作很關(guān)鍵！

測(cè)定意義：

樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分 析。

測(cè)定原理：

強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與 CuSO4 形成紫色絡(luò)合物；紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成 正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

該方法測(cè)定范圍為 1~10mg 蛋白質(zhì)，適用于蛋白質(zhì)濃度高的樣品，尤其是動(dòng)物材料。

試劑組成和配制

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 瓶，5 mg/mL，4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取

1. 液體樣品：澄清無色液體樣品可以直接測(cè)定。

2. 組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液（自備，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水）） 冰浴勻漿，8000g，4℃離心 10min，取上清，即待測(cè)液。（動(dòng)物樣品常常需要稀釋）

3. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建 議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

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測(cè)定操作

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 540 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取 1 mL 玻璃比色皿，加入 200μL 蒸餾水，1000μL 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min，于 540nm 比色，記為 A 空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 1 mL 玻璃比色皿，加入 200μL 標(biāo)準(zhǔn)液，1000μL 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min，于 540 nm 比色，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管：取 1 mL 玻璃比色皿，加入 200μL 待測(cè)液，1000μL 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min，于 540nm 比色，記為 A 測(cè)定管。

注意：

空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。 樣品中蛋白質(zhì)濃度計(jì)算公式 C 待測(cè)（mg/mL）= C 標(biāo)準(zhǔn)管×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管) =5×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)

注意事項(xiàng)：

1.樣品蛋白濃度須在 1~10mg/ml 范圍內(nèi)，低于 1mg/ml 不能用此法，高于 10mg/ml 須做相應(yīng) 稀釋。因此測(cè)定前用 1~2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保蛋白濃度在 1~10mg/ml 范圍內(nèi)。

2.待測(cè)樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的 PBS 提取。該法受硫酸銨、Tris 緩 沖液干擾，提取液中應(yīng)不含這些物質(zhì)；否則改用 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

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