貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)實驗操作方法

實驗原理

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本飽和，為使干細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代(再培養(yǎng))。傳代培養(yǎng)是一種將細(xì)胞種保存下去的方法，同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。

實驗材料

CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、培養(yǎng)瓶、試管、移液管、巴斯德吸管、廢液缸、75％秀精棉球、酒精燈、貼壁細(xì)胞株、*培養(yǎng)基(RPMLI640或DMEM)、0.25％胰蛋白酶、PBS液。

操作步驟

(1)傳代前準(zhǔn)備

A.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

B.消毒：用75％酒精棉球擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。

C.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

D.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。

E.超凈工作臺內(nèi)拆除已消毒空培養(yǎng)瓶的外包裝。

F.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后放入超凈工作臺內(nèi)。

G.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出干細(xì)胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在顯微鏡下觀察細(xì)胞。

H.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。

(2)胰蛋白酶消化

A.入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBs清洗(沖洗)，加入適量消化液(胰蛋白酶液)，注意消化液的量以蓋住細(xì)胞，*消化溫度是37℃。

B.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時細(xì)胞消化適度。

C.終止消化：加入與消化液等體積的新鮮培養(yǎng)液。

(3)吹打分散細(xì)胞

A.打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。

B.吸細(xì)胞懸液人離心管：將細(xì)胞懸液吸人10 mL離心管中。

C.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機(jī)中，以1000r／min離心5 min。

D.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2mL培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

(4)分裝稀釋細(xì)胞

A.裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2—3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

B.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要時計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105個／mL。做好標(biāo)記。

(5)繼續(xù)培養(yǎng)

用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放人CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2h后開始貼附在瓶壁上。

注意事項

A.嚴(yán)格的無菌操作。

B.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)干細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。