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1．腫瘤細胞在96孔細胞培養(yǎng)板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164細胞的培養(yǎng)液（含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液），37℃ 5％ CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3小時，讓細胞帖壁。
2．用RPMI-1640培養(yǎng)液10倍遞次稀釋TNF標準品，根據(jù)需要3～5倍遞次稀釋待檢樣品，每孔加0.1ml稀釋的標準品或待檢樣品，每個稀釋度3個重復孔。對照孔6個，3個陽性對照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培養(yǎng)液，3個陰性對照孔各加100μl RPMI-1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)18～24小時。
3．甩去培養(yǎng)液，用PBS小心洗滌一次，每孔加0.1ml 10％甲醇溶液固定腫瘤細胞30秒鐘。
4．吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml結(jié)晶紫染液，室溫中放置20分鐘。
5．輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將培養(yǎng)板倒置于吸水紙上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室溫中長期保存。
6．測定前，每孔加0.1ml 33％醋酸脫色，充分振蕩后在570nm處測定光吸收度。用光吸收度（OD）值對樣品稀釋度作圖，比較標準品曲線和待檢樣品曲線即可得到待測樣品中的腫瘤細胞因子活性。
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