我們采用兩次酶消化、梯度離心分離得到腦微血管段，探索各種不同的培養(yǎng)條件，成功地進(jìn)行了較純的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞純度可達(dá)90%以上，而且細(xì)胞得率較高，10只動物可培養(yǎng)8~10個35 mm一次性塑料培養(yǎng)皿，培養(yǎng)面積大約80~100 cm2，與國內(nèi)的一些方法相比，細(xì)胞得率有明顯的提高。

 
由于新生鼠易于混有較多的雜細(xì)胞且大腦較小以及哺乳期小鼠優(yōu)于超過1月齡的小鼠，我們采用小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)周齡哺乳期的SD小鼠作為培養(yǎng)材料。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的關(guān)鍵是首先分離獲得純度較高且活力好的腦微血管段。在解剖過程中仔細(xì)去除軟腦膜、大血管及大腦白質(zhì)收集大腦皮質(zhì)，可減少成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的生長，對于提高內(nèi)皮細(xì)胞的純度具有重要意義。由于膠原酶對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷較小，我們采用0.1%Ⅱ型膠原酶消化剪碎后的大腦皮質(zhì)分散組織，同組織勻漿法相比，酶消化法可避免組織勻漿對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而有利于提高細(xì)胞的活力。經(jīng)膠原酶消化后采用20% BSA或15%葡聚糖離心可分離腦微血管段與神經(jīng)組織及大血管，得到底層的腦微血管段，這種方法被廣泛應(yīng)用于腦微血管段的分離，我們發(fā)現(xiàn)20% BSA較15%葡聚糖而言，其分離獲得的腦微血管段數(shù)量更多，而且腦微血管段狀態(tài)更好更易貼壁生長。由于周細(xì)胞是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)中zui常見的雜細(xì)胞，它會明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長，因此原代培養(yǎng)中應(yīng)盡量減少周細(xì)胞的數(shù)量，我們采用兩次酶消化方法，控制兩次酶消化的時(shí)間，用0.1%膠原酶/消化酶分散出內(nèi)皮細(xì)胞外圍的周細(xì)胞，zui后采用一定濃度的連續(xù)梯度的Percoll分離以去除周細(xì)胞和紅細(xì)胞得到較純的腦微血管段。在酶消化過程中加入適量的DNA酶可分散消化過程中釋放的DNA所引起的微血管段凝結(jié)塊，有利于增加微血管段的得率。對于Percoll離心，我們嘗試了3個濃度(33%、45%及50%)后發(fā)現(xiàn)，濃度越大，腦微血管段離靠近離心管底的紅細(xì)胞及周細(xì)胞越遠(yuǎn)，分離效果也越好，因此采用50% Percoll效果，并且采用水平轉(zhuǎn)頭的低溫離心機(jī)以提高離心效果。內(nèi)皮細(xì)胞純化的其他方法有機(jī)械刮除法、克隆培養(yǎng)法、FACS分類法、Thy1.1免疫反應(yīng)殺傷法、采用血漿來源的胎牛血清、磁珠結(jié)合法等，但是我們發(fā)現(xiàn)機(jī)械刮除法和克隆培養(yǎng)法并不適合大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的純化，因?yàn)樵鷥?nèi)皮細(xì)胞傳代后狀態(tài)不佳且易被雜細(xì)胞所抑制，而后面幾種方法比較昂貴不予推薦；血漿來源的胎牛血清不含PDGF，不促進(jìn)雜細(xì)胞的生長，但是其較昂貴，可選擇胎牛血清用于原代培養(yǎng)。
 
腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)需要涂布明膠、鼠尾膠、纖連蛋白等基質(zhì)以利于腦微血管段貼壁和內(nèi)皮細(xì)胞的生長。我們嘗試不同基質(zhì)后發(fā)現(xiàn)其對腦微血管段的貼壁和內(nèi)皮細(xì)胞的生長作用不同，纖連蛋白/IV型膠原優(yōu)于鼠尾膠，而鼠尾膠比明膠好，而且接種密度的要求前者比后兩者要低，后兩者需要達(dá)到一定密度才有利于腦微血管段貼壁。另外我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞不易生長于玻片上，而較易生長于塑料培養(yǎng)皿上，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符。內(nèi)皮細(xì)胞生長需要添加內(nèi)皮細(xì)胞生長因子以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖抑制雜細(xì)胞的生長，我們采用bFGF可有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長，同時(shí)添加100 μg/ml肝素協(xié)同bFGF的作用并可抑制平滑肌細(xì)胞的生長。同時(shí)為了保證內(nèi)皮細(xì)胞的營養(yǎng)，并去除腦微血管段的殘余碎片，我們采用20% FBS的血清濃度并隔天換液。
 
我們培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈短梭形，區(qū)域性單層生長，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，可見"漩渦狀"分布，約5~7天后，各區(qū)域之間可逐漸融合，其形態(tài)和生長特點(diǎn)與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道相似。根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞的短梭形的形態(tài)特點(diǎn)、Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)陽性可鑒定我們所培養(yǎng)的細(xì)胞確為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
 
我們的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立，對于研究腦內(nèi)皮的生理、生化及藥理研究是一個較好的工具，同時(shí)可與星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)用于構(gòu)建血腦屏障模型。相信隨著技術(shù)方法的不斷改進(jìn)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的模型將逐漸接近于其在體特征，并被廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究。