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Western blot發(fā)光檢測中常見的問題及解決方法

閱讀:2560      發(fā)布時間:2017-3-27
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 免疫印跡試驗(Western blot)是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法,被廣泛應(yīng)用于蛋白表達水平的研究、抗體活性檢測和早期疾病診斷等多個方面。其中較為簡單也為大家所普遍接受的Western blot顯色方法為底物化學發(fā)光法ECL。

 

*,Western blot的原理是蛋白質(zhì)在電力場的作用下,由大到小的進行排列,利用電泳進行分離和富集。擁有抗原表位的蛋白質(zhì)分子被抗體(一抗)特異性識別并與之結(jié)合。在此基礎(chǔ)上,酶或熒光標記的二抗識別并結(jié)合一抗,通過與底物反應(yīng)顯色來觀察目的蛋白。
 
Western blot顯色的方法主要有以下幾種:
     一、放射自顯影;
     二、 底物化學發(fā)光ECL;
     三、底物熒光ECF;
     四、底物DAB呈色。
 
現(xiàn)常用的有底物化學發(fā)光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot顯色底物是化學發(fā)光底物,發(fā)表文章通常也是用底物化學發(fā)光ECL。
 
ECL法檢測辣根過氧化物酶的原理是辣根過氧化物酶在H2O2存在下,氧化化學發(fā)光物質(zhì)魯米諾(lumino,氨基苯二酰一肼)并發(fā)光,在化學增強劑存在下光強度可以增大1000倍,通過將印記放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。ECL法操作簡便,應(yīng)用現(xiàn)成的試劑盒(abs920),按照說明,將兩種顯色底物等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻,用玻璃膠片把膜包起來,馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面,顯影、定影(或用熒光檢測儀檢測)。ECL法具有靈敏度高,線性范圍廣等特點。

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