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講述蛋白酶K的特點及其分類

閱讀:3432      發(fā)布時間:2018-5-9
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  蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理,它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用,以增加探針與靶核酸結(jié)合的機會,提高雜交信號.但蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時,都會對細胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞,導(dǎo)致組織切片的脫落,細胞核的消失,從而影響雜交結(jié)果。EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用,解決上述出現(xiàn)的問題,并能達到理想的染色效果。
 
  蛋白酶K的應(yīng)用比較廣泛,它可以消化包圍靶DNA蛋白,因此使用蛋白酶K能夠增加探針 與靶核酸結(jié)合的機會增強雜交信號,但在使用蛋白酶K時要主要使用的濃度,過高或者過低都會破壞細胞的結(jié)構(gòu)、核消失等影響試驗結(jié)果。
 
  蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶,它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵,此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定,還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力,因而它應(yīng)用很廣泛,包括制備脈沖電泳的染色體DNA,蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶,蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml.在較廣的pH范圍內(nèi)(pH 4-12.5)均有活性。推薦反應(yīng)緩沖液:50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。
 
  蛋白酶K配制標準:20mg/ml蛋白酶K配制標準(proteinase K):將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中,輕輕搖動,直至蛋白酶K*溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml,然后分裝成小份貯存于-20℃.蛋白酶K的保存:保存在-20℃冰箱里,避免反復(fù)凍融,有效保證12月.孵育溫度為55至65℃,理想孵育溫度為58℃,孵育時間為15分鐘至48小時;理想孵育時間為2小時.

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