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如何用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中的單個核細(xì)胞?

閱讀:2850      發(fā)布時間:2021-5-27
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  淋巴細(xì)胞分離液是一種根據(jù)細(xì)胞密度差異,借助離心產(chǎn)生的重力加速度,進(jìn)行細(xì)胞的分離純化的常用試劑。常用的淋巴細(xì)胞分離液有Ficoll淋巴細(xì)胞分離液、Percoll淋巴細(xì)胞分離液。Ficoll與Percoll分離單個核細(xì)胞的方法均為密度梯度離心法。分離原理:外周血中單個核細(xì)胞和單核細(xì)胞,其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同,淋巴細(xì)胞分離液是一種密度介于1.075~1.090之間而近似于等滲的溶液,用它做密度梯度離心,使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布,從而將各種血細(xì)胞加以分離。
如何用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中的單個核細(xì)胞?
  1.抽取正常人靜脈血加到肝素抗凝管中,加等量含5~10IU/ml肝素的無血清緩沖液懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液小心加在與血液等量的淋巴細(xì)胞分離液上,室溫中,水平離心500×g20分鐘。此時離心管中形成5層:最上面是血漿,血漿層和淋巴細(xì)胞分離液之間是PBMC,淋巴細(xì)胞分離液層和最下面的紅細(xì)胞層之間是粒細(xì)胞層,又成為棕黃層。
  2.吸去最上層的血漿,收集血漿層和淋巴細(xì)胞分離液交界面的單個核細(xì)胞,盡量全部吸出PBMC。加1~2倍量含5IU/ml肝素、2%滅活小牛血清的Hanks液(洗滌液),混勻后離心200×g10分鐘,低速離心有利于去除細(xì)胞懸液中留存的血小板,去上清液。
  3.再用同樣洗滌液洗滌細(xì)胞2次,每次離心500×g10分鐘,洗去殘留的淋巴細(xì)胞分離液。用1%臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力(應(yīng)>95%)并計(jì)數(shù)細(xì)胞。再用含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。通常,每毫升外周血可得1×106~2×106PBMC。

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