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一、RNA提取

 1、樣本裂解：

 組織樣本： Trizol用量：每 50-100 mg 組織加 1 mL Trizol，樣品體積不應超過 Trizol 體積的 10％。
（1）將動物或植物組織切成小塊，在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理。
（2）將研磨好的組織粉末快速轉入裝有 1 mL Trizol 的 2 mL 離心管中，在渦旋振蕩器上迅速振蕩混勻，置于冰上， 待所有的樣品研磨完。
（3）裂解產物應呈澄清的透明粘稠液體。對于富含蛋白、脂肪或多糖物質的組織樣品如肌肉、脂肪組織和植物結節(jié)部位等，勻漿后仍會存留有不溶物質，可于 4℃ 12,000 x g 離心 10 min，然后吸取上清至一新的離心管中。

 細胞樣本：
（1）貼壁細胞：吸盡培養(yǎng)液，每 10 cm2培養(yǎng)面積（6 孔板單孔或 35 mm 平皿）加入 1 mL Trizol，用加樣器吹打數(shù)次，以確保細胞裂解，然后轉移至離心管中。 注：Trizol 的使用量應由培養(yǎng)皿表面 積決定，而非由細胞數(shù)目決定。Trizol 量不足可能導致提取的 RNA 中有 DNA 污染 。
（2）懸浮細胞：離心收集細胞，吸盡液體，每 5-10×106動植物或酵母細胞，或每 1×107細菌細胞加入 1mL Trizol， 用加樣器吹打，使其裂解，然后轉移至離心管中。 注：添加 Trizol 前切勿洗滌細胞 ，以免 RNA 降解。必要時可以用勻漿器來裂解某些細菌或者酵母細胞 。

2、液相分離：

（1）裂解產物于室溫放置 5 min，使核酸-蛋白復合物分離。（注：此時樣品可在-80℃長期保存。 ）
（2）每 1 mL Trizol 加入 0.2 mL 氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩 15 s，室溫放置 2-3 min。
（3）4℃ 12,000 x g 離心 15 min，樣品會分成三層：桔黃色的下層有機相，中間層和無色的上層水相。
（4）吸取含總 RNA 的上層水相至一新的離心管中，吸取水相的體積為所用 Trizol 試劑的 60％。

3、RNA 回收

（1）按照每 1 mL Trizol 的最初使用量加入 0.5 mL 異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫放置 10 min。
（2） 4℃ 12,000 x g 離心 10 min，棄除上清，可見膠狀的 RNA 沉淀。
（3）按照每 1 mL Trizol 的最初使用量加入 1 mL 75%乙醇，顛倒數(shù)次混勻，洗滌沉淀。
（4）4℃ 12,000 x g 離心 5 min，棄除上清。
（5）室溫倒置 5-10 min 晾干或真空抽干（不要使用真空干燥離心機，以免 RNA 過干，難以溶解）。
（6）加入適量（如 25uL） DEPC-ddH2O 或 TE 緩沖液，用加樣器吹打數(shù)次溶解 RNA。
（7）通過 RNA 電泳以及紫外分光光度計檢測，確定 RNA 的濃度、純度和完整性。
（8）所得的 RNA 應立即使用或適量分裝后-80℃保存，避免反復凍融。

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二、逆轉錄

1、去除RNA中基因組DNA殘留：

混勻，并短暫離心，反應條件為37℃，5 min。
* 采用自備的序列特異性引物時，RNA 模板的量可調整為“≤ 5 ug total RNA 或≤ 0.5 ug poly(A) mRNA"

2、在上述的反應管中，直接添加如下的反轉錄反應所需組分，進行第一鏈cDNA 的合成步驟：

3、輕輕混勻，短暫離心；42℃孵育15-50 min。注意：復雜模板逆轉錄溫度可升高至50℃，提高反轉錄效率。
反應時間可根據實驗應用場景做適當調整。如合成的cDNA 用作qPCR 模板，則反應條件為42℃孵育15 min。

4、85℃加熱5 min 失活Enzyme mix。

5、反應結束后所得的cDNA，請置于冰上進行后續(xù)實驗或冷凍保存。

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三、qPCR實驗

染料法qPCR （以abs601511產品為例）

用戶需自備的試劑：cDNA 或 DNA 模板、引物、ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II。

請按照不同品牌熒光定量PCR儀的使用說明書要求進行實驗操作。

操作示例：分別以20 µ l和50 µ l PCR反應體系為例：

1、PCR 反應體系的建立：

注：
*模板量： 10-100 ng基因組DNA，或 1-10 ng cDNA 為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不同，可對模板進行梯度稀釋，以確定最佳的模板使用量。 另外， Two Step RT-PCR 反應的cDNA（ RT 反應液）作為模板時的添加量不要超過 PCR 反應液總體積的10% 。
*引物：通常引物濃度以 0.2 μM 可以得到較好結果，可以終濃度 0.1-1.0 μM 作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應體系。為了獲得理想的 qPCR 的效果，擴增片段的長度建議為 80-200 bp 。
*不同儀器所需 ROX Reference Dye不同，或需要添加或不需要添加，請根據儀器說明進行操作。

2、PCR 反應條件的設置： 本制品中使用的HotStart Taq DNA Polymerase是利用抗Taq抗體封閉的HotStart DNA聚合酶，如果在PCR反應 前進行模板的預變性，通常設定為95℃、2 min，復雜或高GC模板適當延長時間至5 min。該DNA聚合酶在15 s內可完成至 少300 bp的擴增，可以滿足絕大多數(shù)的qPCR實驗；對于超過350 bp或者高GC含量的擴增子，建議增加延伸時間至60 s或者采用三步法以提高擴增效率。

注 ： 以上舉例為常規(guī) qPCR反應系統(tǒng)，僅供參考。實際反應條件因模板、引物等的結構不同而各異 ， 需根據模板、引物、目的片段的特點設定最佳反應條件，并根據比例放大或縮小反應體系。

3、在相應的 Real Time PCR 儀器上完成實驗，并分析結果。

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