化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH） 樣本的前處理
閱讀：518 發(fā)布時(shí)間：2021-7-76-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH） 樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線(xiàn)粒體蛋白的分離：
① 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿 600g，4℃離心5min。
③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心10min。
④ 上清液即為除去線(xiàn)粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線(xiàn)粒體泄漏的 NOX（此步可選做）。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線(xiàn)粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于NOX活性測(cè)定。
血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）試劑四于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min。
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL試劑四和40μL試劑五，混勻，記錄600nm處20s時(shí)吸光值A(chǔ)1和1min20s后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
NOX 活力單位的計(jì)算
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清（漿）NOX活力的計(jì)算:
單位的定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。
NOX（U/mL）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NOX活力的計(jì)算:
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變