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小鼠肝星狀細(xì)胞永生化細(xì)胞專用培養(yǎng)基的操作需嚴(yán)格遵循無菌規(guī)范，以確保細(xì)胞活性和實驗數(shù)據(jù)的可靠性。以下為關(guān)鍵注意事項的補充說明：

**培養(yǎng)基預(yù)處理**

解凍后的培養(yǎng)基需在4℃避光保存，使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫（25±2℃），避免溫度驟變導(dǎo)致蛋白沉淀。若發(fā)現(xiàn)絮狀物，需立即以1000rpm離心5分鐘去除雜質(zhì)，切勿直接過濾，以防生長因子損失。

**補液策略優(yōu)化**

換液時建議保留原培養(yǎng)基30%-50%，尤其在高密度培養(yǎng)階段（細(xì)胞融合度＞80%），可減少細(xì)胞應(yīng)激。添加5mM谷氨酰胺增強劑時，需分次混勻（每次添加1ml震蕩10秒），避免局部濃度過高。

** 氣體平衡控制**

使用三氣培養(yǎng)箱（5% CO?/5% O?/90% N?）時，需預(yù)先平衡培養(yǎng)基2小時，pH值穩(wěn)定在7.4±0.2。開放式操作需在厭氧工作站內(nèi)完成，單次暴露時間不超過3分鐘。

** 污染監(jiān)測方案**

每周用0.1μm孔徑濾膜過濾儲備液，并采用PCR法檢測支原體（建議選用16S rRNA通用引物）。若細(xì)胞出現(xiàn)偽足回縮等異常形態(tài)，可添加1%雙抗-抗真菌復(fù)合劑（含兩性霉素B 2.5μg/ml）應(yīng)急處理。

** 凍存適配調(diào)整**

使用該培養(yǎng)基制備凍存液時，需將DMSO濃度降至8%，并添加10%海藻糖作為低溫保護劑。程序降溫階段應(yīng)以-1℃/min速率降至-80℃，再轉(zhuǎn)入液氮保存。