国产精品视频一区二区三区四,亚洲av美洲av综合av,99国内精品久久久久久久,欧美电影一区二区三区电影

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系（穩(wěn)定表達細(xì)胞株）指在細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達特定基因或干擾特定基因表達。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的目的基因質(zhì)粒DNA整合到細(xì)胞染色體上，使細(xì)胞長期穩(wěn)定表達該基因。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株包括多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。慢病毒感染目的細(xì)胞后，通過抗性基因篩選得到的細(xì)胞株是多個細(xì)胞克隆的組合。單克隆細(xì)胞株是從多克隆細(xì)胞中經(jīng)細(xì)胞克隆挑選得到的，由一個細(xì)胞擴增得到的細(xì)胞株。單克隆細(xì)胞株性狀統(tǒng)一，傳代過程中細(xì)胞的基因表達保持穩(wěn)定。

用轉(zhuǎn)染質(zhì)?；虿《厩秩镜姆椒▽?gòu)建好的含靶基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞，根據(jù)不同的基因載體中所含的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物進行篩選混合陽性克隆。在陽性混合克隆的基礎(chǔ)上，得到單細(xì)胞長出的陽性單克隆，繼而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。常用的真核表達載體的抗性標(biāo)志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新mei素（neomycin）。

篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的兩種方法
      1、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，單克隆方法篩選穩(wěn)定細(xì)胞系
      對大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低。對于基因過表達，如果轉(zhuǎn)染效率達到40%，基因過表達尚可。但是對于基因干擾實驗，對轉(zhuǎn)染效率要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基因過表達，通常質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無法滿足。
      另外，質(zhì)粒游離于細(xì)胞質(zhì)中，很快降解，無法滿足較長時間的檢測項目；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合幾率極低，穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建耗時耗力，且得率很低，往往需要挑取單克隆株。
      2、病毒感染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株
      病毒感染方法較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選單克隆方法更方便和高效，是目前主流的穩(wěn)定細(xì)胞系篩選方法。用慢病毒制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，由于其高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達、宿主范圍廣，感染效率高，且與細(xì)胞染色體整合而不發(fā)生基因重排，是制備穩(wěn)定細(xì)胞株的理想載體。
      穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株服務(wù)流程
     1、載體構(gòu)建：將外源基因構(gòu)建到合適的載體上，如需病毒轉(zhuǎn)染，則包裝病毒。
     2、篩選濃度測定：以 10-14 天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度。
     3、細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染實驗前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長率和細(xì)胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達到 60%-80% 覆蓋。
     4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用構(gòu)建好的載體（或包裝好的病毒）轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。
     5、抗生素篩選。
     6、鑒定篩選結(jié)果。
    終交付
    1、病毒滴度檢測報告；穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；
    2、結(jié)題報告，包括詳細(xì)的實驗流程，測序結(jié)果和峰圖、引物序列、載體圖譜和滴度測定報告和q-P