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原代BMDM細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)分享及5AZA調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境機(jī)制研究
研究背景
5-aza-2'-脫氧胞丁胺(5AZA)作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑,可激活腫瘤適應(yīng)性免疫并抑制腫瘤進(jìn)展,但其調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境的分子機(jī)制尚未wan全闡明。本研究聚焦于結(jié)直腸癌(CRC)腹膜癌(PC)免疫微環(huán)境,探討5AZA的作用機(jī)制。
研究方法與結(jié)果
通過流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)PCR、Western印跡及藥物親和力響應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性(DARTS)技術(shù),發(fā)現(xiàn)5AZA可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1樣表型極化,增強(qiáng)p65磷酸化及IL-6表達(dá),進(jìn)而激活轉(zhuǎn)移前脂肪組織中的T細(xì)胞,抑制免疫功能小鼠模型中的CRC-PC。機(jī)制研究表明,ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A9(ABCA9)是5AZA的直接作用靶點(diǎn),其通過依賴ABCA9的方式誘導(dǎo)膽固醇積累,激活NF-κB通路。藥理學(xué)抑制NF-κB或敲除IL-6可消除5AZA的抗腫瘤效應(yīng)。此外,5AZA與常規(guī)化療藥物(5-Fu或OXP)聯(lián)用可協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤效果。臨床樣本驗(yàn)證顯示,5AZA可重編程CRC患者基質(zhì)巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能。
轉(zhuǎn)染方法總結(jié)(原代BMDM細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染)
采用ZETA life Advanced DNA RNA轉(zhuǎn)染試劑(#AD600150)進(jìn)行ABCA9 siRNA轉(zhuǎn)染,具體步驟如下:
1. **細(xì)胞接種**:將原代BMDM巨噬細(xì)胞以2.5×10? cells/孔密度接種于6孔板,待細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
2. **轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備**:室溫下將10 µL siRNA(100 pmol/mL)與10 µL轉(zhuǎn)染試劑混合,孵育15分鐘。
3. **轉(zhuǎn)染操作**:將復(fù)合物加入含1 mL正常DMEM培養(yǎng)基的孔中,孵育24小時(shí)后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),后續(xù)收集細(xì)胞用于檢測(cè)。
引用產(chǎn)品與技術(shù)優(yōu)勢(shì)
**熱門產(chǎn)品**:
- AD600150:Advanced DNA RNA轉(zhuǎn)染試劑(適用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞)
- AV500150:小動(dòng)物活體轉(zhuǎn)染試劑
- P400150:Sirius DNA轉(zhuǎn)染試劑
- 胎牛血清(烏拉圭血源Z7181FBS-500、澳洲血源Z7010FBS-500)
- 雙抗(BM0001-100)、0.25%胰酶(BM0002-100)
**ZETA life第三代轉(zhuǎn)染技術(shù)優(yōu)勢(shì)**:
1. **低毒性**:多肽小分子轉(zhuǎn)染試劑可快速代謝,無細(xì)胞毒性。
2. **廣譜適用性**:有效轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞(如THP-1、RAW264.7、原代BMDM)、懸浮細(xì)胞、干細(xì)胞及原代細(xì)胞(如肝細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞等)。
3. **高兼容性**:已成功應(yīng)用于多種細(xì)胞類型(如腫瘤細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞)的基因沉默與過表達(dá)研究,相關(guān)成果發(fā)表于 *Theranostics*(IF=12.40,DOI: 10.7150/thno.66420)等高水平期刊。
結(jié)論
本研究shou次揭示5AZA通過ABCA9依賴的膽固醇代謝重編程巨噬細(xì)胞,激活T細(xì)胞抗腫瘤免疫,為腫瘤免疫治療提供了新靶點(diǎn)。ZETA life轉(zhuǎn)染試劑在原代細(xì)胞及難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的高效性,為機(jī)制研究提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐,推動(dòng)了腫瘤免疫微環(huán)境領(lǐng)域的深入探索。
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