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貼壁/懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染-RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染操作步驟和注意事項(xiàng)

閱讀:9506        發(fā)布時(shí)間:2019/12/2
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本文以RFect Plasmid DNA Transfection Reagent(RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑盒),作為攜帶質(zhì)粒穿膜的載體物質(zhì),具體介紹DNA轉(zhuǎn)染方法。

圖. 用本產(chǎn)品4ul轉(zhuǎn)染1ug pEGFP-C2質(zhì)粒到293T細(xì)胞后,綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。


貼壁/懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染-RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染方法步驟:  

一、貼壁/懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染操作流程(以24孔板轉(zhuǎn)染為例)

A. 細(xì)胞接種:
1. 轉(zhuǎn)染前24小時(shí)左右對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接,接種密度約為每孔0.3~1×105個(gè)細(xì)胞; 
2. 過夜培養(yǎng)。

B. RFect /DNA復(fù)合物包裝(該步完成后應(yīng)立即轉(zhuǎn)染):
1. 在1.5 ml無菌離心管中加入50 μl無血清培養(yǎng)基,并添加適量的轉(zhuǎn)染試劑(2~5 μl/μg DNA,參見下表)。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5~10分鐘。 
2. 在1.5 ml無菌離心管中加入50 μl無血清培養(yǎng)基,并添加適量的DNA(0.8~1μgDNA/孔, 參見附表)。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5~10分鐘。
3. 將RFect-培養(yǎng)基混合物滴加至DNA-培養(yǎng)基混合物中,用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15~20分鐘后,立即轉(zhuǎn)染。注意: RFect-培養(yǎng)基混合物和DNA-培養(yǎng)基混合物的混合次序非常重要,切勿顛倒。

C.貼壁/懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染-RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染:
注意:RFect在*培養(yǎng)基中(基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血清)具有很高的轉(zhuǎn)染效率,因此轉(zhuǎn)染前后不需要換成無血清培養(yǎng)基。
1. 如特殊情況,可在轉(zhuǎn)染開始之前更換新鮮的含血清培養(yǎng)基,以防轉(zhuǎn)染后孵育階段細(xì)胞密度太大、營養(yǎng)不足導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。
2. 將步驟B制備的復(fù)合物滴加至培養(yǎng)基中。輕輕晃動培養(yǎng)皿以使復(fù)合物均勻分布。 
3. 過夜培養(yǎng)24~48小時(shí)。 
4. 注意:如果轉(zhuǎn)染后需要更換新鮮培養(yǎng)基,請于加入RFect/DNA復(fù)合物12~24小時(shí)后進(jìn)行。培養(yǎng)基更換后,孵育24~48小時(shí)后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
5. 收獲細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備及注意事項(xiàng):

1. 細(xì)胞接種:一般做轉(zhuǎn)染前一天接種/鋪板(細(xì)胞計(jì)數(shù)參見說明書,細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml),使做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度在30-50%;如果細(xì)胞是原代細(xì)胞,接種密度可以密一些,細(xì)胞計(jì)數(shù)在2*10^6cell/ml;懸浮細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種/鋪板(細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml),待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度30-40%。

2. 為了能在使用時(shí)有較好的轉(zhuǎn)染效果,第1次使用建議您用24孔板做,每孔1ug質(zhì)粒,設(shè)置質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑2ul,3ul,4ul三個(gè)梯度,每個(gè)梯度做2-3個(gè)復(fù)孔(至少2個(gè)復(fù)孔,避免實(shí)驗(yàn)誤差)。DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的比例,通常推薦是1:2-1:3。轉(zhuǎn)染條件(質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑的用量、比例)放大到對應(yīng)的孔板即可。

3. 用來稀釋siRNA和稀釋轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基必須是無血清培養(yǎng)基,因?yàn)檠宓拇嬖跁蓴_DNA與轉(zhuǎn)染試劑的混合,并且影響轉(zhuǎn)染效率;

4. 檢測方法:轉(zhuǎn)染后48h收細(xì)胞做qPCR基因水平檢測或者轉(zhuǎn)染后72h收細(xì)胞提蛋白做western Blotting蛋白水平檢測。

三、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染一般疑難問題及解決方法

1、低轉(zhuǎn)染效率:  
1)轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA的比例不合
根據(jù)建議選用配比濃度,詳見下表。

 
2)細(xì)胞狀態(tài)不佳,過密或過稀疏
細(xì)胞狀態(tài)不佳,細(xì)胞營養(yǎng)不良,細(xì)胞伸展不好,細(xì)胞密度稀疏,細(xì)胞過密都影響轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)左右對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接,接種密度約為每孔0.3~1×105個(gè)細(xì)胞即可。

3)抗生素?fù)p傷細(xì)胞
轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中含有抗生素會影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑相當(dāng)于細(xì)胞打孔,這時(shí)培養(yǎng)基中存在抗生素則會進(jìn)一步損傷細(xì)胞。

2.高細(xì)胞毒性: 
1)質(zhì)粒DNA受內(nèi)毒素污染,或其他化學(xué)物質(zhì)的污染
未使用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒,對細(xì)胞損傷很大。轉(zhuǎn)染過程中會造成細(xì)胞死亡。 

2)轉(zhuǎn)染后換液
使用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑,轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)必須進(jìn)行換液,否則會由于轉(zhuǎn)染試劑毒性而引細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)所采用的RFect試劑盒在*培養(yǎng)基中具有很高的轉(zhuǎn)染效率,操作簡便,可用于含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前后不需要更換培養(yǎng)液。

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