酶聯(lián)免疫斑點實驗 (enzyme linked immunospot assay, ELISpot) 是一種在96孔板內的一百萬個細胞中實現(xiàn)對單個分泌細胞進行定量檢測的新型的免疫酶技術。靈敏度高，易操作，成本相對流式細胞術較低，已被廣泛應用于癌癥研究，疾病探索以及疫苗研發(fā)等領域。

ELISpot原理：將細胞置于包被有特異性抗體的96孔板中培養(yǎng)，在有刺激的條件下，細胞分泌的細胞因子或免疫球蛋白會被包被抗體捕獲。移除細胞后，被捕獲的細胞因子可進一步使用生物素標記的二抗來標識，其后再與酶標記的親和素作用，并加入底物使其呈色，有反應作用的細胞會留下直徑大小不等的染色斑點。

常見疑難問題解答：

1.推薦哪種ELISpot板子？

建議使用PVDF膜的96孔ELISpot板子，有效結合大量捕獲抗體，前提是膜用乙醇預處理（即活化）。

2.板的顏色是否重要，我應選擇白色板子還是透明板子？

白色和透明ELISpot板具有相同類型的PVDF膜。這兩種顏色在讀板儀中略有不同，但并不重要。（如果有沒有添加液體的漏掉的孔，透明的板子很容易看見。）

3.包被前為什么要用乙醇對ELISpot板進行預處理？

ELISpot板子的膜具有多孔疏水結構。為了使大量捕獲抗體能夠結合，應該用乙醇處理膜以使其親水。這是獲得高質量斑點所必需的致密抗體包被層。ELISpot板子的逐步預包被和EtOH處理的protocol。

4.冷凍細胞可以用于ELISpot嗎？

冷凍保存的細胞非常適合ELISpot。然而，其結果取決于細胞的質量，必須建立冷凍/解凍的程序以產(chǎn)生具有高活力的細胞。標準冷凍程序應包括使用DMSO和胎牛血清或類似物，并逐步冷凍程序。

5.在ELISpot中每孔使用多少個細胞？

必須將每個孔中的細胞數(shù)量調整為細胞類型和分泌細胞的預期頻率。如果頻率非常低，例如10,000個細胞中的1個，則需要更多數(shù)量的細胞，通常約250,000個細胞/孔。當分泌細胞的頻率高時，例如10個細胞中的1個，約5,000個細胞/孔就足夠了。細胞數(shù)量在測定中并不總是顯示線性，因為需要細胞-細胞的zui佳接觸，例如抗原呈遞細胞的充分刺激。當分析抗原特異性T細胞時，PBMC不應低于每孔200,000個細胞。

通常不建議使用超過500,000個細胞/孔，因為這可能產(chǎn)生多個細胞層，反過來由于細胞和ELISpot膜之間的距離增加而導致斑點質量降低。

6.可以在ELISpot中使用人血清嗎？

由于以下原因，不建議在ELISpot中使用人血清。當分析人類樣品時，感興趣的分析物（例如IFN-γ或IgG）實際上可能存在于血清中。由于分析物將與捕獲和檢測抗體結合，因此會導致膜變暗。人血清可能含有嗜異性抗體，其可與來自許多物種的Ig交叉反應。這種反應可能會導致雙抗夾心免疫檢測中抗體交聯(lián)的問題。在ELISpot中，它將導致膜的普遍變暗。

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