封閉對于防止轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)、膜和實(shí)驗(yàn)中使用的后續(xù)試劑之間的非特異性相互作用至關(guān)重要。非特異性結(jié)合會產(chǎn)生背景信號，從而干擾結(jié)果解釋。Jackson ImmunoResearch艾美捷教你如何選擇合適的封閉試劑。

封閉試劑的選擇取決于蛋白質(zhì)印跡檢測步驟中使用的二抗的種類。

蛋白封閉劑

封閉溶液的蛋白質(zhì)成分應(yīng)與被檢測的抗原和二抗的種類相容。

牛血清白蛋白 (BSA) 和脫脂奶粉通常用于封閉溶液，因?yàn)樗鼈兗缺阋擞秩菀撰@得。然而，它們并不總是合適的，并且可能是背景的原因。

當(dāng)使用針對來自?；蛳嚓P(guān)物種（如羊駝、山羊、馬或綿羊）的抗體的抗體時，應(yīng)避免使用 BSA 和脫脂奶粉。在許多 BSA 制劑中發(fā)現(xiàn)低水平的牛免疫球蛋白 G (IgG)。

建議使用來自標(biāo)記二抗宿主物種的正常血清作為較佳封閉劑，以避免任何不必要的相互作用。使用前應(yīng)制備新鮮的血清工作溶液，通常在浸入膜之前在所選緩沖液中稀釋至 5% w/v。

緩沖溶液

通常使用 pH 范圍高于大多數(shù)抗體（pH 范圍 7.5-8.5）的等電點(diǎn) (pI) 的緩沖溶液，例如 Tris 緩沖鹽水 (TBS) 或磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)。如果磷酸化蛋白是印跡的焦點(diǎn)，則不推薦使用 PBS。

這是因?yàn)橐豢箍梢耘c緩沖液中的磷酸鹽以及靶蛋白結(jié)合。還應(yīng)考慮緩沖液 pH 值對檢測步驟中使用的報告酶（例如堿性磷酸酶）活性的影響。

非離子洗滌劑

非離子去污劑通常包含在蛋白質(zhì)印跡中使用的緩沖液中。它們可以防止聚集，這本身會導(dǎo)致背景，但也可以綁定到可能導(dǎo)致非特定交互的任何站點(diǎn)。

Tween-20™（通常為 0.1%）通常用作緩沖添加劑。

Jackson ImmunoResearch艾美捷 關(guān)于孵化時間和洗滌問題：

應(yīng)確定實(shí)現(xiàn)較佳信噪比所需的最短可能阻塞持續(xù)時間。雖然在 4°C 下過夜封閉可能很有吸引力，但過度封閉孵育會導(dǎo)致聚集和細(xì)菌生長，這可能會導(dǎo)致背景或干擾可視化。

封閉過程可能需要通過改變組分及其濃度、時間和溫度來進(jìn)行優(yōu)化，以獲得比較低的背景和比較高的信噪比。

值得注意的是，在封閉后用不含其蛋白質(zhì)成分的緩沖液清洗膜很重要，因?yàn)樗梢愿纳埔豢箤乖砦坏脑L問。

注意：專有的阻塞解決方案

有幾種預(yù)配制的封閉溶液可供使用，它們在市場上銷售時適用于所有實(shí)驗(yàn)條件。情況可能并非總是如此，盡管它們可能足以滿足一組條件。重要的是要考慮后續(xù)試劑的種類可能會排除使用通用封閉溶液，并且使用標(biāo)記抗體種類的正常血清可能更可靠。

注意：用 BSA 或牛奶封閉

牛血清白蛋白 (BSA) 和奶粉可能含有牛 IgG?？寡蝰?、抗牛、抗山羊、抗馬和抗羊抗體會與牛 IgG 發(fā)生反應(yīng)。使用 BSA 或奶粉進(jìn)行封閉或稀釋可能會顯著增加背景和/或降低抗體滴度，應(yīng)避免使用具有這些特異性的抗體；使用標(biāo)記二抗宿主物種的正常血清 (5% v/v)。如果 BSA 被視為封閉劑，請使用不含 IgG 的試劑以降低背景電位。

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