FLICA® 是通過檢測來評估細(xì)胞死亡的有力方法體外凋亡。免疫化學(xué)技術(shù)（ICT）FLICA

熒光標(biāo)記的抑制劑與活性半胱天冬酶共價結(jié)合的CAspa酶1,2。FLICA測量細(xì)胞內(nèi)的凋亡過程，而不是副作用，如磷脂酰絲氨酸的翻轉(zhuǎn)，并消除假陽性的發(fā)生率經(jīng)常困擾著諸如附錄V和TUNEL染色。FLICA也可用于測量焦下垂，一種高度炎癥性的細(xì)胞程序性死亡。

Caspase已在從秀麗隱桿線蟲到人類。哺乳動物半胱天冬酶在細(xì)胞凋亡和炎癥中起著不同的作用。在凋亡中，效應(yīng)半胱天冬酶（-3、-6和-7）負(fù)責(zé)蛋白水解導(dǎo)致細(xì)胞解體的裂解。Caspase觸發(fā)（-8、-9，和-10）調(diào)節(jié)上游細(xì)胞凋亡。Caspase-1與焦下垂和炎癥小體活性，并發(fā)揮關(guān)鍵作用持家酶將pro-IL-1?蛋白轉(zhuǎn)化為活性IL-1?細(xì)胞因子。（使用FLICA套件#98、#9122和#9162檢測caspase-1.）請注意，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞具有已顯示在激活后能快速分泌caspase-1，4，5。

與大多數(shù)其他蛋白酶一樣，胱天蛋白酶的合成如下：

經(jīng)歷蛋白水解成熟的前體具有相似特異性的酶自動催化或級聯(lián)6活性半胱天冬酶由兩種大的（約20kD）和兩種非共價結(jié)合形成兩個異二聚體、四聚體活性胱天蛋白酶7-9。激活的半胱天冬酶通過識別3或4必須包含天冬氨酸（D）殘基的氨基酸序列P1位置。該C-末端殘基是裂解的目標(biāo)每個FLICA探針都含有一個3或4被不同活化的胱天蛋白酶靶向的氨基酸序列。該目標(biāo)序列夾在綠色熒光燈之間標(biāo)簽、羧基熒光素（FAM）和氟甲基酮（FMK）。

市面上常見的是檢測細(xì)胞裂解液中的Caspase-1活性，更多研究者希望動態(tài)檢測活細(xì)胞內(nèi)的Caspase-1的活性，做更真實的實驗！艾美捷推薦Immunochemistry Tech（ICT）的FLICA系列科研工具，進(jìn)一步快速準(zhǔn)確的進(jìn)行Caspase-1活性分析。  

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒原理：

FLICA試劑FAM-YVAD-FMK（Ex/Em = 488nm/530nm），是無細(xì)胞毒性的，細(xì)胞膜滲透抑制劑。進(jìn)入每個細(xì)胞，并不可逆地與活化的caspase-1結(jié)合。任何未結(jié)合的FAM-YVAD-FMK-FLICA試劑擴(kuò)散出細(xì)胞并被沖走。因此留在細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光直接體現(xiàn)了活性caspase-1酶活性的。熒光結(jié)果可通過熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

圖：人單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞用ICT的綠色FAM-FLICA多胱天蛋白酶雙重染色抑制劑試劑FAM-VAD-FMK（試劑盒#92）和藍(lán)色DNA染色劑Hoechst 33342用1µM星孢菌素在37°C下孵育3小時以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然后在37°C下用FAM-VADMK標(biāo)記細(xì)胞60分鐘。清洗細(xì)胞，然后Hoechst加入染色劑并孵育5分鐘。濕式安裝準(zhǔn)備好幻燈片，拍攝并疊加兩張照片。使用條帶檢測Caspase活性（綠色）通濾波器（488nm激發(fā)；520nm發(fā)射）。原子能的Hoechst 33342的染色使用UV過濾器進(jìn)行（365nm激發(fā)，480nm發(fā)射）。只有一個單元格這三個細(xì)胞是凋亡的（中間）用FLICA FAM-VAD-FMK測定半胱天冬酶活性。它也有很多Hoechst染色的亮藍(lán)色斑點，表明DNA正在斷裂，細(xì)胞開始死亡。這個缺乏綠色染色右下角的細(xì)胞表明它是活的（不是凋亡的）。上部左細(xì)胞壞死（無綠色，分散藍(lán)色）。簡短數(shù)據(jù)或Brian W.Lee博士，ICT。

艾美捷Caspase-1活性分析試劑盒：

Caspase Inhibitor Reagent (part#) Trial Standard

Poly Caspase FAM-VAD-FMK (637) 91 92

Caspase-1, 4, & 5 FAM-YVAD-FMK (655) 97 98

Caspase-1, 4, & 5 FAM-WEHD-FMK (6708) 9161 9162

Caspase-2 FAM-VDVAD-FMK (680) 918 919

Caspase-3/7 FAM-DEVD-FMK (653) 93 94

Caspase-6 FAM-VEID-FMK (654) 95 96

Caspase-8 FAM-LETD-FMK (656) 99 910

Caspase-9 FAM-LEHD-FMK (677) 912 913

Caspase-10 FAM-AEVD-FMK (682) 922 923