夾心法TR-FRET免疫檢測法，用于細胞裂解液中磷酸化4EBP1（T37/T46）的半定量檢測。完整的檢測驗證信息可在技術資料表中查閱。詳細的檢測操作步驟描述于通用用戶手冊中。檢測性能的對比分析展示在更新后的應用說明書中。

艾美捷BioAuxilium-THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET細胞信號檢測試劑盒組分：

Eu-磷酸化4EBP1抗體（25 µL）

Acc-磷酸化4EBP1抗體（100 µL）

4EBP1對照裂解液（200 µL）

5倍濃縮裂解緩沖液2（5 mL）

10倍濃縮TR-FRET檢測緩沖液（250 µL）

100倍濃縮磷酸酶抑制劑混合液（250 µL）

BioAuxilium-THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET細胞信號檢測試劑盒(#KIT-4EBP1P-500)配套試劑：

THUNDER™ 4EBP1對照裂解液

THUNDER™裂解緩沖液2（5倍濃縮）

THUNDER™ TR-FRET檢測緩沖液（10倍濃縮）

THUNDER™磷酸酶抑制劑混合液（100倍濃縮）

THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET細胞信號檢測試劑盒檢測原理：

磷酸化4EBP1（T37/T46）檢測試劑盒是一種均相時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）夾心免疫檢測法（見圖1）。THUNDER™細胞信號傳導檢測工作流程包含3個步驟（見圖2）。在細胞處理后，首先使用試劑盒中提供的特定裂解緩沖液將細胞裂解。然后，通過一對熒光標記的抗體以簡單的“加入-孵育-測量"格式（單步試劑添加；無需洗滌步驟）檢測細胞裂解液中的磷酸化4EBP1（T37/T46）。其中一個抗體標記有供體熒光團（銪螯合物；Eu-Ab1），另一個抗體標記有遠紅接受體熒光團（FRAb2）。兩種標記抗體結(jié)合到目標蛋白上不同的表位，使兩種染料靠近。使用閃光燈（320或340 nm）或激光（337 nm）激發(fā)供體銪螯合物分子時，會觸發(fā)從供體到接受體分子的FRET，接受體分子隨后在665 nm處發(fā)射TR-FRET信號。銪螯合物的剩余能量在615 nm處產(chǎn)生光。665 nm處的信號與細胞裂解液中磷酸化4EBP1（T37/T46）的濃度成正比。數(shù)據(jù)可以表示為665 nm處的信號，或665 nm/615 nm的比值。

圖1：TR-FRET細胞信號測定原理的示意圖。

圖2：使用2板（轉(zhuǎn)移）協(xié)議的檢測工作流程。

試劑盒性能對比——與其他TR-FRET技術的比較

作為檢測驗證的一部分，THUNDER™磷酸化4EBP1（T37/T46）檢測試劑盒與一種競爭性TR-FRET檢測技術（公司A）進行了性能對比。具體而言，兩種不同的檢測方法在檢測A431細胞經(jīng)PP242處理后基礎磷酸化4EBP1（T37/T46）抑制的能力上進行了并排比較，實驗采用雙板檢測協(xié)議。所有試劑均按照各自制造商的推薦進行準備。細胞處理后，使用相應試劑盒的1X補充裂解緩沖液將細胞裂解。隨后，裂解液在同一塊384孔檢測板上按照相應試劑盒的標準協(xié)議進行測試。在孵育4小時后，使用EnVision®（閃光燈激發(fā)）讀取結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示，兩種TR-FRET檢測方法表現(xiàn)出相當?shù)撵`敏度（IC50值）和信背比（S/B）。

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