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技術(shù)文章

CHO細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染與基因表達

閱讀:677          發(fā)布時間:2018-7-30

1、pcDNA3.1+-gD的線性化: pcDNA3.1+使用說明書推薦了以下幾個酶作為線性化酶(BglⅡ MfeⅡ Bst1107Ⅰ Eam1105Ⅰ PvuⅠ ScaⅠ SspⅠ),通過DNAMAN分析gD序列發(fā)現(xiàn)其帶有MfeⅡ酶切位點。

2、轉(zhuǎn)染前一天,在60mm的dish中接種8×105個細胞,加入5ml培養(yǎng)基(含血清,不含抗生素),37℃,5%CO2培養(yǎng),至轉(zhuǎn)染時要求細胞40%-80%匯合。

3、通過分光光度計測定pcDNA3.1+-gD的濃度,用不含血清、抗生素、蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基稀釋2.5ug的pcDNA3.1+-gD至總體積150ul,其小濃度不低于0.1ug/ul,稀釋后應(yīng)顛倒幾次EP管以混勻混合物。

4、向混勻的混合物中加入15ul轉(zhuǎn)染試劑(PolyFect Transfection Reagent  QIAGEN),用加樣器吹打5次。

6、在室溫下(20-25℃)孵育混合物5-10分鐘。

7、在孵育的同時,吸出dish中的培養(yǎng)基,用PBS液洗滌一次,加入3ml的培養(yǎng)基(含血清,不含抗生素)。

8、孵育完成后加入1ml培養(yǎng)基(含血清),用加樣器吹打2次,將產(chǎn)物全部加入60mm的dish中,輕輕搖動dish以混勻。

9、37℃,5%CO2培養(yǎng),在細胞匯合度不超過50%時加入G418進行篩選。

轉(zhuǎn)染時轉(zhuǎn)染兩組細胞,組一在轉(zhuǎn)染后細胞匯合度不超過50%時(一般是24小時)加入G418進行篩選;組二在轉(zhuǎn)染后待細胞匯合度達到80%時1/4000、1/1000、1/300分別接種于dish中,48小時后加G418篩選。

10、加入G418后,每3天更換一次含有篩選濃度的G418。當(dāng)有大量細胞死亡(5-7天)時,可以把G418的濃度減半維持篩選(此時可以加入適應(yīng)性培養(yǎng)基1:4來改善細胞對培養(yǎng)基的同化作用)。

11、篩選10-14天后,可見有抗性的克隆出現(xiàn),停藥培養(yǎng),待其逐漸增大后,制備細胞懸液,記數(shù),用培養(yǎng)基稀釋細胞到1個/10ul。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔,再加入細胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入48孔板中增殖(為了減少實驗失誤帶來的風(fēng)險建議凍存部分增殖細胞)。

12、細胞大量擴增后,提取總DNA,做PCR檢測目的基因是否存在。

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