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沒想過我養(yǎng)的細胞會凍壞,過來人告訴你幾點經(jīng)驗總結(jié)
閱讀:1009 發(fā)布時間:2018-10-8想要長期持有一個細胞系,策略是進行低溫保存。這可以有效防止因污染或技術(shù)原因?qū)е碌募毎麚p失。而低溫保存對于維持細胞株的遺傳特性也極為重要。
看似簡單的凍存細胞,如果操作不當,將導(dǎo)致長期培養(yǎng)的細胞付之東流。作為一個吃過虧的人,告訴你細胞凍存是否成功取決于以下四個關(guān)鍵因素(文章結(jié)尾有福利,等不及的小伙伴可以拉至底部)。
一、適當?shù)奶幚砑皽睾褪占毎?br />
凍存前檢查
凍存前,細胞應(yīng)處于指數(shù)生長期,確保細胞處于健康狀態(tài)。理想情況下,應(yīng)在收獲細胞前 24 小時更換培養(yǎng)基。建議對培養(yǎng)物進行微生物污染物,特別是支原體的檢測,并通過適當?shù)姆椒?,?STR 分析確定其身份。
如果在培養(yǎng)過程中使用抗生素,那么建議在冷凍前 1 到 2 周不使用抗生素,這樣如果出現(xiàn)污染,可以更容易地發(fā)現(xiàn)。
收集細胞
通常,您可以使用常規(guī)用于細胞傳代的實驗程序來收獲細胞。細胞收獲期間盡可能溫和操作。本程序推薦的試劑量是針對為 75 平方厘米(T-75)培養(yǎng)瓶;若使用其他培養(yǎng)容器,請相應(yīng)調(diào)整所用試劑量。
1. 使用無菌吸管,取出并丟棄培養(yǎng)基。請妥善處置與細胞接觸的任何材料和溶液。
2. 用 5 到 10 ml CMF-PBS 沖洗細胞,去除所有痕量的血清。
3. 加入 3 到 5 ml 的胰酶(在 CMF-PBS 中),37℃ 孵育。預(yù)熱酶溶液通常會縮短處理時間。
4. 在倒置相差顯微鏡上每隔幾分鐘檢查酶處理的進展情況。一旦細胞變圓,輕輕敲擊細胞瓶使其脫離塑料表面。加入 5 ml 含血清的生長培養(yǎng)基滅活胰酶??赡苄枰獎×业囊埔翰僮鱽硎古囵B(yǎng)容器底部的剩余細胞脫落,或?qū)⒓毎麍F塊分解成單細胞懸浮液。胰酶的去除或失活對于冷凍細胞至關(guān)重要。如果游離試劑不能直接滅活,可以通過下一步的離心去除。
5. 用 15ml 離心管收集細胞。取出樣本進行細胞計數(shù),剩余的細胞懸液以約 100×g 離心 5 分鐘以獲得細胞沉淀。離心時,用細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)。使用臺盼藍染液檢查細胞的活性。
二、使用合適的冷凍保護劑
5%~10% 的甘油和 DMSO 是常見的凍存保護劑。雖然 DMSO 對細胞有毒性,但是與甘油相比,其滲入細胞的速度更快,而且凍存重復(fù)性更好(細胞復(fù)蘇效率更好)。
但是,DMSO 一方面會導(dǎo)致某些細胞(如 HL-60 早幼粒細胞)分化,另一方面對某些細胞(如 HBE4-E6/E7 肺上皮細胞)的毒性也過大。對于這些細胞,則應(yīng)使用甘油。甘油可以通過高壓蒸汽滅菌,而 DMSO 只能通過過濾除菌。DMSO 或者甘油至少應(yīng)達到試劑級(或者更別,如細胞培養(yǎng)級),并且分裝,避光保存。
三、細胞凍存的速率
有很多方法可以實現(xiàn) 1℃/min 的降溫速度。電腦控制的可編程電子降溫系統(tǒng)是的方式,可以保持降溫速度。這也是 ATCC 采用的方法。但這種設(shè)備價格較高。比較經(jīng)濟的方式是將凍存管放置于凍存盒中,在低于 –70℃ 的冰箱中凍存 24 小時。已有一些商業(yè)化凍存盒產(chǎn)品能夠非常接近 1℃/min 的理想降溫速度。
四、合適的儲存溫度
長期保藏需要超低溫(低于 -130℃)環(huán)境,可以使用低溫冰箱,更普遍的方法是保存在液氮罐中。
要維護液氮中儲存的細胞需要記住以下幾點:
1. 確保標簽系統(tǒng)適用于低溫儲存。
2. 保持良好記錄,包括細胞儲存位置,生長特點和操作記錄。
3. 請頻繁檢查液氮罐的狀態(tài)(每天或至少每周一次)。有多種商用警報系統(tǒng)可用于持續(xù)監(jiān)控其狀態(tài)。珍貴細胞應(yīng)至少存放在兩個不同的地點。
后,關(guān)于養(yǎng)細胞這件小事,還想提醒大家一句:如果你購買了 ATCC 細胞系,為了保證培養(yǎng)基一致性的問題,購買細胞時,一起購買推薦培養(yǎng)基。因為來自于不同廠家的培養(yǎng)基,即使名字相同或類似,配方也略有差異。