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多元 PCR (多重PCR，Multiplex PCR，MPCR) 是指在一個(gè) PCR 反應(yīng)中使用一個(gè)模板和幾對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段的 PCR 反應(yīng)。這項(xiàng)技術(shù)非常有用，他不僅可以提高 PCR 的產(chǎn)率還能提高 DNA 樣品的利用率。

另一種形式的 MPCR 是組合 PCR, 組合 PCR 是在同一 PCR 反應(yīng)中使用幾個(gè)不同的模板和幾對(duì)引物。多元 PCR 和組合 PCR 往往被當(dāng)作同義詞使用。

設(shè)計(jì)策略

MPCR 要求所有的引物對(duì)在同一條件下擴(kuò)增其各自的特異序列。大多數(shù)多元 PCR 反應(yīng) 局限于擴(kuò)增 5~10 個(gè)目的片段，原因之一是反應(yīng)中，每另加入一對(duì)引物會(huì)導(dǎo)致一定程度的靈活性的丟失。引物數(shù)量的增加也使引物二聚體和非特異擴(kuò)增出現(xiàn)的概率增加。因此，進(jìn)行多元 PCR 要求周密計(jì)劃，且需多次嘗試，使反應(yīng)條件優(yōu)化。

理論上，一個(gè)多元反應(yīng)中，所有引物擴(kuò)增其特異序列的效率應(yīng)該是一樣的，但通常是很難預(yù)測(cè)一對(duì)引物的效率。在相似條件下，退火溫度幾乎相同的寡核苷酸可更好地工作。

多元 PCR 引物設(shè)計(jì)和優(yōu)化的一般規(guī)律

當(dāng)設(shè)計(jì) MPCR 引物時(shí)，除了引物設(shè)計(jì)的一般規(guī)律外，其他一些因素也必須考慮。一般 來說，一個(gè)多元反應(yīng)中使用的所有引物的 Tm 值應(yīng)該接近，要避免 3'-核苷酸互補(bǔ)，每一對(duì)引物應(yīng)獨(dú)立地優(yōu)化其反應(yīng)條件。一旦將引物集中，需按順序混合，然后再進(jìn)行優(yōu)化。

1. 引物長(zhǎng)度應(yīng)為 18~24 個(gè)堿基，較長(zhǎng)的引物更容易形成引物二聚體。

2. 對(duì)于 MPCR，退火溫度和循環(huán)數(shù)非常關(guān)鍵。要盡可能提髙退火溫度，要確認(rèn)每一對(duì) 引物單獨(dú)擴(kuò)增時(shí)的退火溫度，然后在多元 PCR 反應(yīng)時(shí)采用低的退火溫度。同樣，要采用少的擴(kuò)增數(shù)。

3. 由于多個(gè)模板同時(shí)擴(kuò)增，酶量和核苷酸濃度可能成為限制因子，而且*合成所有 產(chǎn)物所需的時(shí)間增加。因此，優(yōu)化每個(gè)反應(yīng)的試劑濃度和延伸時(shí)間就顯得非常重要。相對(duì)于 單個(gè)目的序列的 PCR 而言，多元 PCR 所需延伸時(shí)間較長(zhǎng)。

想多元引物設(shè)計(jì)案例