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技術(shù)文章

皮層/海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)實驗

閱讀:857          發(fā)布時間:2018-12-14

皮層/海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)實驗
實驗方法原理    
神經(jīng)元在發(fā)育過程中早于膠質(zhì)細胞,因此通常選擇胎鼠做腦內(nèi)神經(jīng)元培養(yǎng)。一般取El7-l8d孕大鼠或El4-16d孕小鼠做神經(jīng)元培養(yǎng)。新生1d的仔鼠也可以用來培養(yǎng)神經(jīng)元,但培養(yǎng)成功后雜細胞較多,有時需要進一步純化。這兩個部位的細胞培養(yǎng)方法類似
實驗材料    El7-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠新生Id的仔鼠
試劑、試劑盒    含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基神經(jīng)元維持培養(yǎng)基(Neurobasal+B27+谷氨酰胺)
儀器、耗材    培養(yǎng)瓶
實驗步驟    
1.根據(jù)離心前細胞計數(shù)的結(jié)果,先用少量神經(jīng)元維持培養(yǎng)基重懸細胞,充分重懸后,補加液體至合適體積,按照(2-4)x104/cm2的密度在培養(yǎng)板、玻片等介質(zhì)上接種細胞,并置于37℃孵箱培養(yǎng)。

2.培養(yǎng)過程中接觸細胞要注意動作輕柔,接種Id后應(yīng)避免把細胞從孵箱中拿出,可根據(jù)培養(yǎng)液的顏色和亮度觀察污染情況(污染的細胞,培養(yǎng)液混濁、發(fā)黃;正常應(yīng)該是清亮透明的)。3d后1/3量換液,并可利用神經(jīng)元標志物的免疫化學(xué)染色鑒定純度。第5天起每隔2d 1/2量換液,并可以根據(jù)神經(jīng)元的成熟程度用于實驗。

3.如果覺得神經(jīng)元純度達不到實驗的要求,可以添加阿糖胞苷(終濃度為5µM),作用2d后,1/2量換液,逐漸去除。

培養(yǎng)成功的神經(jīng)元,無污染,相差顯微鏡下細胞折光性好,細胞碎片很少或沒有,突起長,培養(yǎng)基清亮,細胞有一定的間距,沒有成團存在,分布均勻,而且沒有太多的雜細胞。培養(yǎng)不太好的細胞,雜細胞多,神經(jīng)元狀態(tài)一般或很差,細胞碎片較多
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注意事項    
1.神經(jīng)元培養(yǎng)時常為1/2量換液,在換液前應(yīng)將培養(yǎng)液在37℃水浴鍋中充分復(fù)溫,冷刺激和全量換液刺激都會使細胞活力下降。

2.鼠齡越大,其神經(jīng)元的培養(yǎng),操作越要輕柔精細,關(guān)鍵在于消化過程和吹打過程。消化時間、吹打次數(shù)對細胞活力的影響在原代培養(yǎng)中是大的。在保證可以獲得足夠單細胞懸液的前提下,應(yīng)適當(dāng)縮短操作時間和步驟。

3.海馬和皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)沒有大的區(qū)別,皮層細胞豐富,很容易收集細胞,但是雜細胞較多。

4.利用孕鼠做神經(jīng)元的培養(yǎng),純度高于新生鼠,而且活力更好。培養(yǎng)海馬神經(jīng)元時,孕期不足,海馬尚未*形成,較難分離,但是取皮層就沒關(guān)系了。
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其他    
實驗心得:

1.應(yīng)用阿糖胞甘作用于神經(jīng)元,細胞純度會高一些。1/2量換液去除時,雖然會存在殘留,但是這樣的濃度對神經(jīng)元活性的作用基本可以忽略。

2.在包被玻片時,習(xí)慣將8片玻片置于已加入2ml PLL的小皿中,一片一片的加,加完后用彎管小心吹勻,蓋上皿蓋后,輕輕震搖。再放入孵箱包被過夜。包被結(jié)束后,以無菌水漂洗2遍,并以彎攝一片一片的夾出來,置于已滅菌的紗布上,超凈臺內(nèi)吹干。

3.接種細胞爬片時,先以(2-4)X105/100µL的濃度配好單細胞懸液,在玻片上接種100µL,靜置20min后,移至培養(yǎng)箱培養(yǎng),2-3h后補液至400µL。這種方法接種的細胞能夠均勻分布于爬片上。

4.為了避免長時間培養(yǎng)出現(xiàn)培養(yǎng)液變干的情況,可以在培養(yǎng)板每孔之間的間隙加無菌水。

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