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本實(shí)驗(yàn)介紹胰島素受體對胰島素親和性的測定方法。本實(shí)驗(yàn)來源于蛋白質(zhì)純化與鑒定實(shí)驗(yàn)指南

實(shí)驗(yàn)步驟    
材料

[125I]胰島素（受體級）（DuPontNENNEX196)

豬胰島素（如，Sigma Chemical Co,I3505)

牛血淸白蛋白（BSA;1%)

試劑

結(jié)合緩沖液（冷配體置換實(shí)驗(yàn)用)

(配方，見“試劑的配制”，PP.234~240)

操作程序

1)于微量離心管中建立下列反應(yīng)體系：

 

2)各離心管置搖床上，室溫下孵育2h。

3)各管用微型離心機(jī)離心20min,去上清。

4)用γ-計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)離心管內(nèi)的放射性強(qiáng)度。分別從第1至6管的cpm值中減去第7管的cpm值（非特異性cpm值和本底cpm值)，得特異結(jié)合的cpm值。

5)將各管的特異性結(jié)合cpm值除以總cpm值，得與膜結(jié)合的那部分胰島素所占的份額。該值乘以各管中的胰島素濃度，即得配體-受體復(fù)合物的濃度（[HR]，亦稱[B],它表示結(jié)合的配體)。

6)從管中的胰島素濃度減去[HR],得游離配體的濃度（[H],亦稱[F],它表示游離的配體)。

7)至此，可用幾種方法分析所得的結(jié)果。如能用計(jì)算機(jī)程序，將數(shù)據(jù)直接代入下式則更好：

 

也可通過[HR]對log([H])作圖來分析這些數(shù)據(jù)。此圖應(yīng)給出S型曲線。于是，可分別從[HR]的大值和曲線的拐點(diǎn)得出受體總數(shù)和KD值（Klotz,1982)。第三種方法是用斯卡査德（Scatchard)圖分析數(shù)據(jù)，斯卡査德圖就是所作的圖。若只有一種類型的結(jié)合位點(diǎn),則斯卡査德圖為一直線。為作斯卡査德圖，先要確定對應(yīng)于每個(gè)[H]的[HR]/[H]值，然后以[HR]/[H]值對[HR]作圖,此線的斜率為-1/KD，橫坐標(biāo)的截距力受體總數(shù)([R]t)。若有多于一種類型的結(jié)合位點(diǎn),且有不同的親和性時(shí)，斯卡査德圖將是一條曲線而不是直線。