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實(shí)驗(yàn)方法原理    AFLP是通過PCR反應(yīng)先把酶切片段擴(kuò)增，然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳，多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長度不同被檢測出來。實(shí)驗(yàn)中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接，連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)需要通過選擇在末端上分別填加了1～3個(gè)選擇性核苷的不同引物，可以達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的。這些選擇性核苷酸使得引物能選擇性地識別具有特異配對順序的內(nèi)切酶片段，進(jìn)行結(jié)合，導(dǎo)致特異性擴(kuò)增。
實(shí)驗(yàn)材料    DNA樣品
試劑、試劑盒    Taq酶EcoRI MseIEcoRI MseI接頭E+A引物M+C引物T4DNALigaseE和M引物瓊脂過硫酸胺丙烯酰胺尿素硝酸銀甲酰胺dNTPs二甲苯青冰醋酸玻璃硅烷50bpMark
儀器、耗材    電泳儀離心機(jī)Eppendorf管凝膠成像儀紫外分光光度計(jì)37℃水浴鍋PCR儀
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、基因組DNA提取和純化

1. 大量提取DNA（實(shí)驗(yàn)方法視DNA來源而異，此處略）。

2. DNA的純化：

（1）用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg/ml）電泳檢測片段大小，取出其中的1/3已提取的基因組DNA進(jìn)行純化。

（2）首先用TE緩沖液補(bǔ)滿至總體積50ul，再等體積苯酚/異戊醇（25：24：1）、異戊醇（24∶1）各抽提一次。

（3）離心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10體積的NaAC和二倍體積預(yù)冷的無水乙醇，——20℃放置2h以上。

（4）10000xg離心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ，風(fēng)干后溶于30μl TE緩沖液中。

（5）紫外分光光度計(jì)檢測A260、A280值并定量，再用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg/ml）電泳檢測片段大小。

注：0.1-0.2g組織可用100ul溶液E溶，0.5g組織，溶液E可增加至300ul，此時(shí)DNA濃度大約為100ng/ul。

二、限制性酶切及連接

1. 在0.2ml離心管中加入：模板量約為250ng，2.5μl 10×酶切緩沖液， 2.5μl 10×T4DNA連接酶切緩沖液，5U EcoRⅠ， 5U MseⅠ，2U T4連接酶，50pmol MseⅠ接頭，雙蒸水補(bǔ)至25μl。

2. 用PCR擴(kuò)增儀設(shè)定37℃過夜反應(yīng)后，于65℃，20min滅酶活，——20℃保存，作為預(yù)擴(kuò)增模板。

三、預(yù)擴(kuò)增

1. 取3μl酶切連接產(chǎn)物，加入75ng E+A，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30μl。

反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 90s；94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，30循環(huán)；72℃ 10min。

2. 反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg/ml）電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，取3μl產(chǎn)物釋稀50倍，用作選擇性擴(kuò)增模板。

四、選擇性PCR擴(kuò)增

1. 取釋稀后的產(chǎn)物3μl，加入EcoRⅠ選擇性引物、MseⅠ選擇性引物各75ng，15 mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1UTag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30μl。

反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 90s；94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 1min，13循環(huán)（每循環(huán)降0.7℃）；94℃ 30s， 56℃ 1min，72℃ 1min，25循環(huán)；72℃ 5min.

2. 反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5μg/ml）電泳檢測先擇性擴(kuò)增產(chǎn)物。

五、凝膠電泳

1. 擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺膠（厚度0.5mm）和1×TBE電泳緩沖液電泳分離）。拔出梳子，140W恒功率預(yù)電泳30分鐘，溫度達(dá)到47——49℃。務(wù)必使每個(gè)孔清洗出尿素。

2. 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積上樣緩沖液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.25%二甲苯青，0.25%溴酚藍(lán)）94℃變性5 min，結(jié)束后迅速置于冰上直到點(diǎn)樣。

3. 每個(gè)泳道加樣8μl。一開始用100W恒功率電泳約2分鐘，使樣品迅速集中到孔底部，再調(diào)到60W恒功率電泳，溫度保持在43℃左右，待二甲苯青泳動至玻璃板2/3處，結(jié)束電泳。

六、銀染

1. 固定液配制：取100ml冰醋酸到900ml去離子水或雙蒸水中。

染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加去離子水至1L。

顯色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸鈉，加去離子水至1L。

2. 具體操作流程

（1）電泳完畢后，將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤中。

（2）固定：加入固定液，在搖床上輕微震蕩30min。固定結(jié)束后，固定液保留。

（3）加入去離子水漂洗3次，每次2min。

（4）染色：將凝膠放入染色盤中，倒入染色液（4℃），在搖床上輕微震蕩30min。用去離子水漂洗凝膠10秒鐘后，置入顯色盤中。

（5）顯色：加入顯色液（4℃），在搖床上輕微震蕩直至條帶數(shù)不再增加為止。

（6）終止：加入（2）步驟用后的固定液，來回漂幾分鐘。達(dá)到效果后，用蒸餾水漂洗幾分鐘。

（7）去除凝膠和玻璃板上的水珠后，放在白光燈箱上用數(shù)碼相機(jī)拍照。

七、數(shù)據(jù)分析

用BIO-RAD公司的Quantity One 軟件統(tǒng)計(jì)，再用NTSYS軟件計(jì)算出遺傳相似性系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析構(gòu)建聚類圖。