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技術(shù)文章

分子標(biāo)記—AFLP原理和操作步驟

閱讀:691          發(fā)布時(shí)間:2018-12-28

實(shí)驗(yàn)方法原理    AFLP是通過(guò)PCR反應(yīng)先把酶切片段擴(kuò)增,然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳,多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不同被檢測(cè)出來(lái)。實(shí)驗(yàn)中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接,連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)需要通過(guò)選擇在末端上分別填加了1~3個(gè)選擇性核苷的不同引物,可以達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的。這些選擇性核苷酸使得引物能選擇性地識(shí)別具有特異配對(duì)順序的內(nèi)切酶片段,進(jìn)行結(jié)合,導(dǎo)致特異性擴(kuò)增。
實(shí)驗(yàn)材料    DNA樣品
試劑、試劑盒    Taq酶EcoRI MseIEcoRI MseI接頭E+A引物M+C引物T4DNALigaseE和M引物瓊脂過(guò)硫酸胺丙烯酰胺尿素硝酸銀甲酰胺dNTPs二甲苯青冰醋酸玻璃硅烷50bpMark
儀器、耗材    電泳儀離心機(jī)Eppendorf管凝膠成像儀紫外分光光度計(jì)37℃水浴鍋PCR儀
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、基因組DNA提取和純化

1. 大量提取DNA(實(shí)驗(yàn)方法視DNA來(lái)源而異,此處略)。

2. DNA的純化:

(1)用0.8%瓊脂糖凝膠(含EB 0.5μg/ml)電泳檢測(cè)片段大小,取出其中的1/3已提取的基因組DNA進(jìn)行純化。

(2)首先用TE緩沖液補(bǔ)滿至總體積50ul,再等體積苯酚/異戊醇(25:24:1)、異戊醇(24∶1)各抽提一次。

(3)離心吸上清液于Eppendorf管中,加入1/10體積的NaAC和二倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇,——20℃放置2h以上。

(4)10000xg離心10min,用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ,風(fēng)干后溶于30μl TE緩沖液中。

(5)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260、A280值并定量,再用0.8%瓊脂糖凝膠(含EB 0.5μg/ml)電泳檢測(cè)片段大小。

注:0.1-0.2g組織可用100ul溶液E溶,0.5g組織,溶液E可增加至300ul,此時(shí)DNA濃度大約為100ng/ul。

二、限制性酶切及連接

1. 在0.2ml離心管中加入:模板量約為250ng,2.5μl 10×酶切緩沖液, 2.5μl 10×T4DNA連接酶切緩沖液,5U EcoRⅠ, 5U MseⅠ,2U T4連接酶,50pmol MseⅠ接頭,雙蒸水補(bǔ)至25μl。

2. 用PCR擴(kuò)增儀設(shè)定37℃過(guò)夜反應(yīng)后,于65℃,20min滅酶活,——20℃保存,作為預(yù)擴(kuò)增模板。

三、預(yù)擴(kuò)增

1. 取3μl酶切連接產(chǎn)物,加入75ng E+A,75ng M+C引物,15mmol/L Mg2+,25mmol/L dNTPs,1U Tag酶,3μl 10×PCR緩沖液,加雙蒸水補(bǔ)至30μl。

反應(yīng)參數(shù)為:94℃ 90s;94℃ 30s,56℃ 1min,72℃ 1min,30循環(huán);72℃ 10min。

2. 反應(yīng)結(jié)束后,用0.8%瓊脂糖凝膠(含EB 0.5μg/ml)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,取3μl產(chǎn)物釋稀50倍,用作選擇性擴(kuò)增模板。

四、選擇性PCR擴(kuò)增

1. 取釋稀后的產(chǎn)物3μl,加入EcoRⅠ選擇性引物、MseⅠ選擇性引物各75ng,15 mmol/L Mg2+,25mmol/L dNTPs,1UTag酶,3μl 10×PCR緩沖液,加雙蒸水補(bǔ)至30μl。

反應(yīng)參數(shù)為:94℃ 90s;94℃ 30s,65℃ 1min,72℃ 1min,13循環(huán)(每循環(huán)降0.7℃);94℃ 30s, 56℃ 1min,72℃ 1min,25循環(huán);72℃ 5min.

2. 反應(yīng)結(jié)束后,用0.8%瓊脂糖凝膠(含EB 0.5μg/ml)電泳檢測(cè)先擇性擴(kuò)增產(chǎn)物。

五、凝膠電泳

1. 擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺膠(厚度0.5mm)和1×TBE電泳緩沖液電泳分離)。拔出梳子,140W恒功率預(yù)電泳30分鐘,溫度達(dá)到47——49℃。務(wù)必使每個(gè)孔清洗出尿素。

2. 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積上樣緩沖液(98%甲酰胺,10 mmol/L EDTA,0.25%二甲苯青,0.25%溴酚藍(lán))94℃變性5 min,結(jié)束后迅速置于冰上直到點(diǎn)樣。

3. 每個(gè)泳道加樣8μl。一開(kāi)始用100W恒功率電泳約2分鐘,使樣品迅速集中到孔底部,再調(diào)到60W恒功率電泳,溫度保持在43℃左右,待二甲苯青泳動(dòng)至玻璃板2/3處,結(jié)束電泳。

六、銀染

1. 固定液配制:取100ml冰醋酸到900ml去離子水或雙蒸水中。

染色液:1g AgNO3 ,1.5ml 37% 甲醛,加去離子水至1L。

顯色液:30g Na2CO3,1.5ml 37% 甲醛,2mg硫代硫酸鈉,加去離子水至1L。

2. 具體操作流程

(1)電泳完畢后,將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤(pán)中。

(2)固定:加入固定液,在搖床上輕微震蕩30min。固定結(jié)束后,固定液保留。

(3)加入去離子水漂洗3次,每次2min。

(4)染色:將凝膠放入染色盤(pán)中,倒入染色液(4℃),在搖床上輕微震蕩30min。用去離子水漂洗凝膠10秒鐘后,置入顯色盤(pán)中。

(5)顯色:加入顯色液(4℃),在搖床上輕微震蕩直至條帶數(shù)不再增加為止。

(6)終止:加入(2)步驟用后的固定液,來(lái)回漂幾分鐘。達(dá)到效果后,用蒸餾水漂洗幾分鐘。

(7)去除凝膠和玻璃板上的水珠后,放在白光燈箱上用數(shù)碼相機(jī)拍照。

七、數(shù)據(jù)分析

用BIO-RAD公司的Quantity One 軟件統(tǒng)計(jì),再用NTSYS軟件計(jì)算出遺傳相似性系數(shù),用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析構(gòu)建聚類(lèi)圖。

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