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本人具有數(shù)年的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，期間經(jīng)歷了無數(shù)次的失敗和成功，回想起來有苦也有甜，現(xiàn)在把中國疾病預(yù)防控制中心和我自己的經(jīng)驗(yàn)結(jié)合起來，制作成MDCK細(xì)胞培養(yǎng)SOP，歡迎大家參閱：

一、目的

MDCK細(xì)胞培養(yǎng)是分離流感病毒及相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)。疾控中心的所有技術(shù)人員，必須按照本文件相關(guān)的操作規(guī)程進(jìn)行操作。

二、適用范圍

適用于疾控中心所有技術(shù)人員 。

三、程序

（一）生物安全要求

實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別：BSL-1

所有操作必須在BSL-1實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里進(jìn)行。

（二）材料

1. 生長成片的MDCK細(xì)胞

2. 無菌的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

3. D-MEM培養(yǎng)液（含有L-谷氨酰胺）

4. 青、鏈霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸鏈霉素），分裝后保存于-20℃

5. HEPES緩沖液，1M母液

6. 胎牛血清

7. EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分裝后保存于-20℃

8. 7.5%牛血清白蛋白組分V

9. 1mL、10mL無菌移液管

10. 70％～75％的酒精

注意事項(xiàng)：經(jīng)常檢查試劑使用的有效期。

（三）實(shí)驗(yàn)步驟

這里以T75細(xì)胞瓶的單層細(xì)胞培養(yǎng)為例，敘述MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)程序。如果細(xì)胞瓶的規(guī)格有變，MDCK細(xì)胞懸液的量必須做相應(yīng)的調(diào)整。

1. D-MEM培養(yǎng)液的準(zhǔn)備

500mL D-MEM液中加入：

青、鏈霉素母液5mL（終濃度達(dá)：100U/mL青霉素；100µg/mL鏈霉素），

HEPES緩沖液12.5mL（終濃度：25mM）。

7.5%牛血清白蛋白組分Ⅴ 12.5mL

2. 細(xì)胞生長液的準(zhǔn)備

胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液體中，使胎牛血清的終濃度為10%。

3. 首先將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液棄去，加入5mL在37℃水浴中預(yù)熱的EDTA-胰酶。

4. 溫和地?fù)u動(dòng)細(xì)胞瓶1min，使EDTA-胰酶均勻分布在整個(gè)細(xì)胞薄層。然后用移液管吸去EDTA胰酶。

5. 重新加入5mL在37℃水浴中預(yù)熱的EDTA-胰酶重復(fù)上述步驟。

6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均勻分布在整個(gè)細(xì)胞薄層，37℃孵育細(xì)胞瓶直至細(xì)胞從塑料細(xì)胞瓶的表面分離（約5～10min）。必要時(shí)可以搖動(dòng)或吹打來分離細(xì)胞。然后加入1mL胎牛血清滅活殘余的胰酶。

7. 加9mL已經(jīng)配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培養(yǎng)液，輕輕用移動(dòng)移液管來吹散細(xì)胞團(tuán)。

8. 取10mL混合物加到90mL細(xì)胞生長液（細(xì)胞懸液的濃度大約為每毫升含105細(xì)胞）

9. 每個(gè)T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入6mL（6×105/mL）細(xì)胞懸液，剩余的細(xì)胞懸液可以加到T75細(xì)胞瓶用于細(xì)胞傳代。通常6mL細(xì)胞懸液2～3日可生長成片（80％～90％）的單層細(xì)胞。

10. 于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，以供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)用。