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去年9月份的時候，小編推薦了Abcam的WB新手入門課程（每周一節(jié)，共分4節(jié)），不知道小伙伴們有沒有g(shù)et到WB的全套技能呢？現(xiàn)在，Abcam推出了實驗*的升級技能---IHC，同樣是以每周一次課程的形式。跟著小編學(xué)起來吧！

在第 1周的 IHC 培訓(xùn)中，我們將展示如何開啟一個良好的開端。如何制備樣本將會成為決定終數(shù)據(jù)質(zhì)量的重要影響因素。本次培訓(xùn)中，我們將指導(dǎo)您完成 IHC 樣本處理的主要步驟。

1、什么是免疫組化?

免疫組化（immunohistochemistry，IHC）是利用抗原-抗體相互作用顯示組織切片中抗原分布和定位的一種方法。

IHC 常用于診斷癌癥等疾病中的異常細(xì)胞和組織。總體而言，IHC 提供了有價值的觀點和支持，使其他方法獲得的數(shù)據(jù)更加有據(jù)可依。

IHC 染色依賴于識別靶蛋白的抗體，可以通過兩種檢測方法對抗原-抗體的相互作用進(jìn)行可視化，一種是顯色方法（酶偶聯(lián)抗體催化底物顯色，產(chǎn)生有色沉淀）；另一種是熒光檢測法（熒光基團(tuán)偶聯(lián)抗體產(chǎn)生熒光）。

2、標(biāo)本形式

IHC組織保存的兩種主要方法是石蠟包埋和組織冰凍（總結(jié)如下）：

	IHC-石蠟包埋	IHC-組織冰凍
切片厚度	4-5 µm	4-10 µm
固定	10%中性福爾馬林緩沖液 (neutral-buffered formalin, NBF) 預(yù)包埋	切片前或切片后，多聚甲醛、丙酮或丙酮: 乙醇 1:1 溶液
切片	切片機(jī)	冰凍機(jī)
儲存	室溫下儲存數(shù)年（抗原可能隨時間變化）	-80℃ 下儲存 1 年（-190℃ 下保存時間更長）
優(yōu)點	- 形態(tài)結(jié)構(gòu)保存與抗原性的平衡； - 非常穩(wěn)定且易于使用；	- 抗原處于更“天然”的狀態(tài)； - 適用于不耐受標(biāo)準(zhǔn)醛固定和石蠟處理的抗原； - 適用于磷酸化抗原表位；
缺點	- 過度固定（超過 24 小時）可掩蓋抗原表位； - 免疫染色前需要脫蠟； - 使用交聯(lián) [醛] 試劑固定需要進(jìn)行抗原修復(fù)；	- 如果形成冰晶，形態(tài)保存可能比石蠟切片差； - 切片過厚會導(dǎo)致圖像分辨率較低，圖片拍攝效果較差； - 樣本易碎；

3、固定

固定可防止離體組織自溶和壞死，保留抗原特性，提高組織成分的折射率，同時有助于保護(hù)樣本處理過程中的細(xì)胞成分。靶抗原和所需的檢測技術(shù)都會影響固定劑的選擇，如下圖所示。

圖 1：固定劑對免疫染色效果的影響。和甲醛固定（左）相比，用甲醇固定的 HeLa 細(xì)胞（右）中更易檢出組蛋白 H2B K5 巴豆?；庖呓M化結(jié)果。一抗：ab177139，組蛋白 H2B（K5巴豆?；┑耐枚嗫寺】贵w，1 μg/mL。二抗：ab150081，山羊抗兔 IgG H&L (Alexa Fluor® 488)，0.5 μg/mL。DAPI 染核, ab7291 搭配ab150120 染微管蛋白（紅色）。

 

以下是我們關(guān)于固定劑選擇的建議：

· 大多數(shù)低分子量的蛋白質(zhì)、多肽和酶：對于細(xì)胞/細(xì)胞學(xué)樣本制備，使用 4% 甲醛；對于組織切片，使用 10% 中性福爾馬林緩沖（NBF）液；

·  柔軟精細(xì)組織：Bouin 固定液；

·  氨基酸等小分子：4% 甲醛；

·  造血器官（如肝、脾、骨髓）：Zenker 固定液；

·  結(jié)締組織：Helly 固定液；

·  核酸：Carnoy 固定液；

·  大分子蛋白抗原（如免疫球）：冰浴丙酮或甲醇（100%）；

·  細(xì)胞核形態(tài)：福爾馬林-硫酸鋅溶液；

·  電鏡成像：4% 甲醛，1% 戊二醛溶液。

4、包埋和切片

固定組織后需立即處理，以充分保證組織被切成厚度為 4-5 μm 。組織經(jīng)脫水、透明化，然后浸蠟，以進(jìn)行切片。本方案包括

·   石蠟組織處理

·   冰凍組織包埋

·   乙二醇甲基丙烯酸酯 (Glycol methacrylate, GMA) 包埋

小結(jié)

希望您現(xiàn)在已經(jīng)具備良好的前期基礎(chǔ)，可以開始計劃您的 IHC 實驗。您應(yīng)該對樣本制備有更多了解，尤其是：IHC 樣本保存的兩種主要方法，以及組織固定和包埋方法。

下周我們將介紹免疫組化染色原理以及抗原修復(fù)、通透化和封閉。