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實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

 

掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法。

 

了解區(qū)分細(xì)胞存活狀態(tài)的方法。

實(shí)驗(yàn)用品

 

0.4%臺盼藍(lán)溶液、無水乙醇或95%乙醇溶液、脫脂棉

 

普通顯微鏡、試管、吸管、毛細(xì)吸管、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、綢布。

實(shí)驗(yàn)原理

 

在細(xì)胞培養(yǎng)工作中，常需要了解細(xì)胞生活狀態(tài)和鑒別細(xì)胞死活，確定細(xì)胞接種濃度和數(shù)量以及了解細(xì)胞存活率和增殖度，如用酶消化制備的細(xì)胞懸液中細(xì)胞活力的鑒別，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活力檢測等。細(xì)胞懸液制備后，常用活體染料臺盼藍(lán)對細(xì)胞進(jìn)行染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。臺盼藍(lán)不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色。而死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增高，可使染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而使細(xì)胞著色（藍(lán)色）。細(xì)胞計(jì)數(shù)一般用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，便于確定細(xì)胞的生活狀況。

 

 

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法

 

（一）制備動(dòng)物細(xì)胞懸液

 

將動(dòng)物細(xì)胞用生物鹽水制備成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液備用。

 

（二）細(xì)胞計(jì)數(shù)

 

 

1. 計(jì)數(shù)板處理

 

用無水乙醇或95%乙醇溶液擦拭計(jì)數(shù)板后，用綢布擦凈，另擦凈蓋玻片一張，把蓋片覆在計(jì)數(shù)板上面。

 

 

2. 染色

 

用滴管吸取0.4%臺盼藍(lán)染液，按1∶1比例加入細(xì)胞懸液中。從計(jì)數(shù)板邊緣緩緩滴入，使之充滿計(jì)數(shù)板和蓋片之間的空隙中。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中或帶有氣泡，否則要重做。稍候片刻，將計(jì)數(shù)板放在低倍鏡下（10×10倍）觀察計(jì)數(shù)。

 

 

3. 計(jì)數(shù)方法

 

按圖計(jì)算計(jì)數(shù)板的四角大方格（每個(gè)大方格又分16個(gè)小方格）內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，只計(jì)數(shù)完整的細(xì)胞，若聚成一團(tuán)的細(xì)胞則按一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。在一個(gè)大方格中，如果有細(xì)胞位于線上，一般計(jì)下線細(xì)胞不計(jì)上線細(xì)胞，計(jì)左線細(xì)胞不計(jì)右線細(xì)胞。二次重復(fù)計(jì)數(shù)誤差不應(yīng)超過±5%（圖7-1）。鏡下觀察，凡折光性強(qiáng)而不著色者為活細(xì)胞，染上藍(lán)色者為死細(xì)胞。

 

 

4. 計(jì)數(shù)的換算

 

計(jì)完數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)。由于計(jì)數(shù)板中每一方格的面積為0.01 cm2，高為0.01 cm，這樣它的體積為0.0001 cm3，即0.1 mm3。由于1 ml＝1000 mm3，所以每一大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)×10 000＝細(xì)胞數(shù)/ml，故可按下式計(jì)算：

 

細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/ml＝4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4×10 000

 

如計(jì)數(shù)前已稀釋，可再乘稀釋倍數(shù)。

 

計(jì)數(shù)細(xì)胞后，計(jì)算細(xì)胞懸液濃度并求出存活與死亡細(xì)胞數(shù)的比例。

注意事項(xiàng)：

 

向計(jì)數(shù)板中滴細(xì)胞懸液時(shí)要干凈利落，加量要適當(dāng)，過多易使蓋片漂移，或淹過蓋片則失敗，需重做，過少易出現(xiàn)氣泡；不理想時(shí)，應(yīng)重做；

 

鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，若方格中細(xì)胞分布明顯不均，說明細(xì)胞懸液混合不均勻，需重新將細(xì)胞懸液進(jìn)行混合，再重新計(jì)數(shù)。如圖7-1：