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糖原合成酶（GCS）測試盒
閱讀：487 發(fā)布時間：2020-12-1糖原合成酶（Glycogen synthase，GCS）試劑盒說明書
微量法 100 管/96 樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
GCS（EC 2.4.1.11）催化 UDPG 和葡萄糖殘基生成糖原和 UTP，以 α-1，4-糖苷鍵相連延長
糖鏈，是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶，是胰島素作用的主要靶酶，對糖代謝的調(diào)節(jié)和血糖
穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用。
測定原理：
GCS 催化 UDPG 和葡萄糖殘基生成糖原和 UDP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化
NADH 氧化生成 NAD+，在 340nm 下測定 NADH 下降速率，即可反映 GCS 活性。
需自備的儀器和用品：
分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸
餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 18 mL×1 瓶， 4℃保存；
試劑二：液體 2.5mL×1 瓶，4℃保存；
試劑三：液體×1 支，4℃保存；
試劑四：粉劑×1 支， -20℃保存；
試劑五：粉劑×1 支， -20℃保存；
樣本的前處理：
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL
提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 工作液的配制：臨用前將試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；現(xiàn)配現(xiàn)用；
3、 試劑五的配制：臨用前在試劑五中加入 1mL 試劑二充分溶解待用；現(xiàn)配現(xiàn)用；
4、 將工作液和試劑五置于 37℃預(yù)熱 5 分鐘。
5、 在 1mL 微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、10μL 試劑五和 180μL 工作液，立
即混勻，記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A1-A2。
注意：在該試劑盒中，若 ΔA 大于 0.1，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定，使 ΔA 小
于 0.1 可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
GCS 活性計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109
]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
GCS（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109
]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=3215×ΔA÷W
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4
L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103
L / mol /cm；d：
比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：
反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。
b.用 96 孔板測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109
]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
GCS（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109
]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=6430×ΔA÷W
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4
L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103
L / mol /cm；d：
96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：
反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。