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有了這一篇，再也不用問別人，WB蛋白樣品制備常見問題大全！
閱讀：1783 發(fā)布時間：2021-9-8一直都在做蛋白研究，但是樣品制備中的小細(xì)節(jié)你都了解嗎？這里為大家整理了蛋白樣品制備中大大小小的常見問題，一起來學(xué)習(xí)吧！
兩種方式都是可行的，各有利弊。不必?fù)?dān)心刮刀收集會刮壞細(xì)胞，胰酶消化的程度掌握不好，也會讓細(xì)胞破損。胰酶消化可能會對某些膜蛋白產(chǎn)生影響，刮刀收集效率會略低，可根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)來選擇細(xì)胞收集的方式。做總蛋白提取時，可選擇直接在器皿中進(jìn)行裂解，無需提前收集。
PS：使用刮刀收集時，可加入PBS幫助收取細(xì)胞。
當(dāng)然不是，要根據(jù)WB的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定提取哪類蛋白，如需驗(yàn)證某些低豐度蛋白，或蛋白定位，或組分間表達(dá)量對比，則需要進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離或組分分離。
蛋白樣品如果長期保存，或者下游實(shí)驗(yàn)過程較長，建議加入蛋白酶抑制劑。做磷酸化研究，一定要加入磷酸酶抑制劑！
內(nèi)源性蛋白酶存在于胞漿中，所以要在細(xì)胞裂解前加入抑制劑到達(dá)最佳抑制效果，提取時將抑制劑添加到裂解液中，工作濃度1X。例如100X蛋白酶抑制劑，1ml裂解液中添加10ul即可。
產(chǎn)生粘稠物的主要原因是RIPA不能將所有樣品全部裂解，產(chǎn)生的不可溶組分中主要含有核酸殘團(tuán)，細(xì)胞碎片（有些組織樣品還含有油脂），和部分蛋白，因此RIPA提取的僅僅是可溶性蛋白，并非真正的總蛋白。
解決方案：使用柱式法蛋白提取真正意義上的總蛋白
最好是收集完細(xì)胞后馬上進(jìn)行蛋白提取。
濃度測定方法很多，目前推薦使用兼容性較好的BCA法進(jìn)行濃度測定。
蛋白樣品不建議久存，也不要反復(fù)凍融。下游做WB實(shí)驗(yàn)，建議蛋白濃度測定后，加入loading buffer煮樣，煮后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分裝成小管在-80℃，下次使用前拿出小管再次煮樣即可。（詳
蛋白濃度測定后，建議將各個樣品稀釋到某一固定濃度（稀釋可以PBS，水或裂解液），加入loading buffer后，在沸水中煮3-5分鐘，使蛋白充分變性，也可使用PCR儀95度加熱5分鐘。
PS：煮沸并非必須步驟，膜蛋白建議70℃或者更低溫度煮。
煮后在冰上靜置少許時間，進(jìn)行低速離心，即可上樣。
如組織樣品中含血較多，血紅蛋白可能會影響下游實(shí)驗(yàn)， 可以在組織樣品裂解前使用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行處理后，再進(jìn)行蛋白提取。