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技術文章

γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒

閱讀:300          發(fā)布時間:2022-7-6

γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(glutamate cysteine ligase,GCL)說明書

                                                       
                                                                    分光光度法50/48

γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

GCL  GSH 合成的限速酶,GSH  GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調節(jié),如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。


測定原理:

ATPMg2+存在下,GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸;同時ATP去磷酸化產生無機磷分子,通過測定無機磷增加速率,即可計算出GCL活性。

 

自備儀器和用品:

可見分光光度計、冷凍離心機、水浴鍋、移液器、1mL玻璃比色皿、濃硫酸和蒸餾水。

γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒

試劑組成和配

試劑一:液體70mL×1瓶,4保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加14mL蒸餾水充分震蕩溶解。

試劑三:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加入蒸餾水3.5 mL充分震蕩溶解。

試劑四:液體16mL×1瓶,室溫保存。

試劑五:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加入30mL蒸餾水,充分震蕩溶解后,緩緩加入1.0 mL濃硫酸(自備),邊加邊攪拌。

 

粗酶液提?。?/span> 

  1. 組織:按照組織質量(g試劑一(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4離心10min,取上清,置冰上待測。

  2. 細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4,離心10min,取上清置于冰上待測。

  3. 血清等液體:直接測定。

γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒

GCL測定操作

1. 分光光度計預熱30min,調節(jié)波長到660 nm,蒸餾水調零。

2. 空白管:1.5mLEp管,依次加入試劑一240 µL、試劑二260µL、試劑三60µL蒸餾水120µL,混勻后蓋緊,37水浴準確反應15 min 加入試劑四300µL,混勻后,25、8000g離心10 min,取上清500µL加入試劑五500µL,混勻后蓋緊,45水浴10min,冷卻后測定660 nm吸光值,記為A空白管。

3. 測定管:1.5mLEp管,依次加入試劑一240 µL、試劑二260µL、試劑三60µL和上清液120µL,混勻后蓋緊,37水浴準確反應15 min; 加入試劑四300µL,混勻后,25、8000g,離心10 min,取上清500µL,加入試劑五500µL,混勻后蓋緊,45水浴10min,冷卻后測定660 nm吸光值,記為A測定管

注意:空白管只需要測定一次。

GCL活性計算公式:

標準曲線:y=0.1427xR2=0.9987

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義:37下,每毫克蛋白每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCLμg/min /mg prot=[A測定管-A空白管)÷0.1427×V反總]÷(Cpr×V)÷T

=3.815×A測定管-A空白管)÷Cpr

2)按樣本質量計算

活性單位定義:37下,每克組織每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。

GCLμg/min /g鮮重= [A測定管-A空白管)÷0.1427×V反總]÷(W×V÷V樣總)÷T

= 3.815×A測定管-A空白管)÷W

3)按細胞數量計算

活性單位定義:37下,每104個細胞每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位

GCLμg/min /104 cell=[A測定管-A空白管)÷ 0.1427×V反總]÷(細胞數量×V÷V樣總)÷T

= 3.815×A測定管-A空白管)÷細胞數量

4)按照液體體積計算

活性單位定義:37下,每毫升液體每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCLμg/min /mL= [A測定管-A空白管)÷ 0.1427×V反總]÷V÷T

=  3.815×A測定管-A空白管)

0.1427:回歸方程系數;V反總:反應總體積(mL980µL=0.980mL;Cpr:上清液蛋白質濃度,mg/mLV樣:加入反應體系中上清液體積,120µL =0.12 mL;V樣總:加入提取液體積,1mLW:樣本質量,g;T:反應時間:15min。

γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒

注意事項:

1)樣品處理等過程均需要在冰上進行,且須在當日測定酶活力,以免影響其活力。如果是勻漿液,避免反復凍融。

2)所有試劑配制完后,除表明4保存外,請于1天內用完。

3)實驗過程請帶手套,試劑三中有強腐蝕性物質,注意不要濺到皮膚上或眼睛內。

4)測定吸光值時請于水浴后1040分鐘內測完。

5)樣本測定前先取1-2個樣做預實驗,如吸光值太高,應先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當倍數,使得吸光值在標準曲線范圍內,哺乳動物組織和血液一般稀釋35倍。

6)試劑三配制過程中,可能會產生黑色固體,其不影響結果,注意吸取時不要將黑色固體吸入。

7)細胞中GCL活性測定時,細胞數目須在300-500萬之間,細胞中GCL的提取時可加試劑一(或生理鹽水)后研磨或超聲波處理,不能用細胞裂解液處理細胞;γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒


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