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γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒
閱讀：305 發(fā)布時間：2022-7-6γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase，GCL）說明書
分光光度法50管/48樣
γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒
注 意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對 GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。
測定原理：
在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同時ATP去磷酸化產(chǎn)生無機磷分子，通過測定無機磷增加速率，即可計算出GCL活性。
自備儀器和用品：
可見分光光度計、冷凍離心機、水浴鍋、移液器、1mL玻璃比色皿、濃硫酸和蒸餾水。
γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒
試劑組成和配制：
試劑一：液體70mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加14mL蒸餾水充分震蕩溶解。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入蒸餾水3.5 mL充分震蕩溶解。
試劑四：液體16mL×1瓶，室溫保存。
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入30mL蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入1.0 mL濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。
粗酶液提取：
組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
血清等液體：直接測定。
γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒
GCL測定操作
1. 分光光度計預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到660 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一240 µL、試劑二260µL、試劑三60µL和蒸餾水120µL，混勻后蓋緊，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min； 再加入試劑四300µL，混勻后，25℃、8000g，離心10 min，取上清500µL，加入試劑五500µL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660 nm處吸光值，記為A空白管。
3. 測定管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一240 µL、試劑二260µL、試劑三60µL和上清液120µL，混勻后蓋緊，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min； 再加入試劑四300µL，混勻后，25℃、8000g，離心10 min，取上清500µL，加入試劑五500µL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660 nm處吸光值，記為A測定管。
注意：空白管只需要測定一次。
GCL活性計算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.1427x，R2=0.9987
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /mg prot）=[（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T
=3.815×（A測定管-A空白管）÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。
GCL（μg/min /g鮮重）= [（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 3.815×（A測定管-A空白管）÷W
（3）按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：37℃下，每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /104 cell）=[（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
= 3.815×（A測定管-A空白管）÷細胞數(shù)量
（4）按照液體體積計算
活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL（μg/min /mL）= [（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷V樣÷T
= 3.815×（A測定管-A空白管）
0.1427：回歸方程系數(shù)；V反總：反應(yīng)總體積（mL）980µL=0.980mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，120µL =0.12 mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間：15min。
γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒
注意事項：
（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當(dāng)日測定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復(fù)凍融。
（2）所有試劑配制完后，除表明4℃保存外，請于1天內(nèi)用完。
（3）實驗過程請帶手套，試劑三中有強腐蝕性物質(zhì)，注意不要濺到皮膚上或眼睛內(nèi)。
（4）測定吸光值時請于水浴后10～40分鐘內(nèi)測完。
（5）樣本測定前先取1-2個樣做預(yù)實驗，如吸光值太高，應(yīng)先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，使得吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，哺乳動物組織和血液一般稀釋3～5倍。
（6）試劑三配制過程中，可能會產(chǎn)生黑色固體，其不影響結(jié)果，注意吸取時不要將黑色固體吸入。
（7）細胞中GCL活性測定時，細胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細胞中GCL的提取時可加試劑一（或生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞；γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶比色法試劑盒