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細(xì)胞傳代培養(yǎng)

閱讀:232          發(fā)布時(shí)間:2018-7-19
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實(shí)驗(yàn)材料

    無(wú)菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca /Mg free, D-PBS,GibcoBRL 21600-010) 
    trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062):以10 ml 分裝于15 ml 無(wú)菌離心管中,保存于–20 oC,使用前放在37℃水槽回溫。 
    新鮮培養(yǎng)基 
    無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶 
實(shí)驗(yàn)步驟

1 附著型胞(adherent cell) 
    1.1 吸掉舊培養(yǎng)液。 
    1.2 用D-PBS 洗滌細(xì)胞一至二次。 
    1.3 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2),37 oC 作用數(shù)分鐘,于倒立顯微鏡下觀察,當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí),吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA,則在trypsin-EDTA 作用后,加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用,離心后再吸掉上清液。) 
    1.4 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落,加入適量之新鮮培養(yǎng)基,以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊,混和均勻后,依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中,以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 
2 懸浮型細(xì)胞(suspension cell) 
    2.1 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液,放入離心管中,離心1000 rpm 5 分鐘。 
    2.2 吸掉上清液,加入適量之新鮮培養(yǎng)基,混和均勻后,依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中,以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 
3 融合瘤(hybridoma) 
    3.1 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體,若是更換培養(yǎng)基,則可能會(huì)失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基,直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大,可傾斜放置,或分殖至新培養(yǎng)瓶中。
 

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