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細胞凋亡檢測實驗形態(tài)學檢測法
閱讀：246 發(fā)布時間：2018-7-23實驗方法原理 根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征，使用合適的顯微鏡檢測凋亡細胞形態(tài)變化。
實驗材料 Hela細胞Jurkat細胞
試劑、試劑盒 DAPIHoechst蒸餾水PBS
儀器、耗材 光學顯微鏡倒置顯微鏡透射電子顯微鏡熒光顯微鏡共聚焦激光掃描顯微鏡
實驗步驟
一、光學顯微鏡和倒置顯微鏡
1. 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
2. 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。
二、 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。
常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258)，DAPI。三種種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。
Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1 mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋，終濃度為10 ug/ml。
DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1 mg/ml的濃度，使用終濃度一般為10 ug/ml。
結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖1)。
三、 透射電子顯微鏡觀察
結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結構(圖2)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
