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實(shí)驗(yàn)方法原理    Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。
實(shí)驗(yàn)材料    細(xì)胞
試劑、試劑盒    Ac-DEVD-AMC磷酸緩沖液蒸餾水脫脂奶粉Caspase-3多抗吐溫
儀器、耗材    硝酸纖維素膜PVDF膜熒光分光光度計(jì)UV流式細(xì)胞計(jì)燒杯移液管引流棒
實(shí)驗(yàn)步驟    

 
一、Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對(duì)底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
 
1.  方法
 
收集細(xì)胞→PBS洗滌→抽提細(xì)胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2 h或4°C過(guò)夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應(yīng)1~2 h或4°C過(guò)夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10 min/次→HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)1~2 h→ TBS-T洗3次， 5~10 min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。
 
2.  結(jié)果

二、 熒光分光光度計(jì)分析
 
1.  原理

活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測(cè)定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。
 
2.  方法

收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞→PBS洗滌→制備細(xì)胞裂解液→加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）→37°C反應(yīng)1 h→熒光分光光度計(jì)（Polarstar）分析熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為430-460 nm）。
 
3.  結(jié)果

三、流式細(xì)胞術(shù)分析
 

1.  方法

收獲細(xì)胞正常或凋亡細(xì)胞→PBS洗滌→加Ac-DEVD-AMC→37°C反應(yīng)1 h→UV流式細(xì)胞計(jì)分析caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度。

2.  結(jié)果