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單層貼壁細胞-細胞毒性試驗-四唑鹽（MTT）比色法-實戰(zhàn)篇
閱讀：457 發(fā)布時間：2018-8-14單層貼壁細胞四唑鹽（MTT）比色法
僅供參考 MTT常用濃度為5mg/ml;
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《動物細胞培養(yǎng)--基本技術指南》
注：此書中MTT濃度為50mg/ml
1、藥物的細胞毒性
四唑鹽（MTT）比色法
操作步驟
接種細胞
（1）用胰蛋白酶消化匯合的單層細胞，將細胞收集到含血清的培養(yǎng)基中。
（2）離心細胞懸液,使細胞沉積下來。用培養(yǎng)基重懸細胞，計數。
（3）將細胞稀釋至2.5×103-50×103 個/ml,每個微滴定板可容納20ml細胞重懸液。
（4）用加樣器在平底96孔板中間十列的各孔中加入200μl細胞懸液，每孔加0.5×103-10×103 個細胞。
（5）將200μl培養(yǎng)基加至第1列和第12列的8個孔中。第1列作讀板議的空白對照。
（6）將培養(yǎng)板放至塑料飯盒中，于37℃濕潤環(huán)境中溫育1-3天，等細胞進入指數生長期時可加入藥物。
添加藥物
（7）用培養(yǎng)基將細胞毒性藥物5倍系列稀釋，共制備8個濃度。
（8）對于貼壁生長的細胞，去除第2-11列各孔的培養(yǎng)基。
（9）在第2列和第11列的8個孔中加入200μl新鮮配制的培養(yǎng)基，這些細胞作為對照。
（10）在第3-10列的細胞中加入細胞毒性藥物。每個藥物濃度僅需4個孔，這樣A-D行可用于種藥物，E-H行用于第二種藥物。
（11）向每組4 孔中各加入200μl藥物溶液。
（12）將培養(yǎng)板放回塑料盒中，溫育至確定時間。
生長期
（13）在藥物作用期結束時，去除所有含有細胞的孔中的培養(yǎng)基，加入200μl新鮮的培養(yǎng)基。
（14）每日換液至2-3個PDTs[群體倍增時間]。
存活細胞數的估算
（15）在生長期末，每孔中各加入200μl新鮮的培養(yǎng)基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。
（16）用鋁箔包裹培養(yǎng)板，于37℃濕潤環(huán)境中溫育4 h。
（17）棄去孔中的培養(yǎng)基和MTT，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解殘留的MTT-甲臜結晶。
（18）在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸緩沖液（每孔25μl）。
（19）立即在570nm處記錄吸光值。讀板儀用第1 列中含培養(yǎng)基和MTT但不含細胞的各孔調零。
分析
以藥物濃度為橫坐標（X軸），吸光值為縱坐標（Y軸）繪制曲線圖。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作為對照吸光值，對照組吸光值減少一半時所需的藥物濃度為IC50 濃度。
四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍，
? 四唑鹽比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。
無菌材料
? 生長液；胰蛋白酶（0.25%+EDTA，1mmol/L,溶于PBSA中）；MTT： 3- (4,5) -雙甲基 - 2 -噻唑 - (2 ,5) -二甲苯基溴化四氮唑，50mg/ml,濾過除菌; Sorensen 甘氨酸緩沖液（0.1mol/L甘氨酸, 0.1mol/L NaCl,用1mol/L NaOH將PH調至10.5 ）;微滴定板（Linbro,ICN）; 微吸頭，放在高壓滅菌的吸頭盒中。
非滅菌材料的準備
? 塑料盒（無毒的聚苯乙烯，裝培養(yǎng)板用）；加樣器；DMSO；ELISA讀板儀。
體會(更新中)
1、盡管細胞計數很重要，考慮到使用血細胞計數板所測結果的不穩(wěn)定性，建議不要過分依賴它。將細胞懸液大體計數并稀釋后，用微量加樣器分裝入一96孔板的 幾個孔內（舊板亦可），鏡下觀察細胞密度是否合適。
2、加樣時使用多道加樣器，盡可能減少加樣誤差。加樣時請注意槍頭有無氣泡產生，避免液體吸入加樣器，勤換槍頭，頻率自己掌握。